弧菌作为近海、河口环境中微生物区系的主要成员，广泛分布于自然水域及渔业生物中，是引发人类细菌性疾病的主要病原之一。人们通过饮用不洁水，食用未加工或未加工熟的带有致病弧菌的食物，特别是海产品而感染发病[1-4]。近年来，海水养殖业的快速发展，加快了海水生境的破坏，养殖环境不断恶化，使养殖动物病害不断发生。弧菌病(Vibriosis) 主要是由弧菌属(Vibrio)细菌引起的一类细菌性疾病，也是海水养殖动物主要的细菌病害之一。已知海水养殖动物弧菌病病原菌超过20种，危害到鱼类、贝类及甲壳类中各种养殖动物，不仅给养殖业造成巨大的经济损失[5]，而且导致野生海水动物大量死亡，进而导致食用人员肠道疾病或食物中毒。弧菌病相关病原的研究已经成为养殖病害及养殖环境治理的主要研究领域之一。

成品设备管道，水箱、雨水回收池等可以采用装配式成品。生活用水水箱采用装配式不锈钢水箱，实用美观、耐久性好。厨房隔油设备采用成品一体化气浮隔油设备，全封闭结构，无臭无异味，易清理；雨水回收池采用PP模块化装配式水池，安装方便，承载力大，清洁卫生。

福建省漳州龙海市东北部的紫泥镇，地处福建省第二大河九龙江出海口，属于咸淡水交汇处，水质较好，水产养殖发达。紫泥围垦区是其中重要的海水养殖区域，同样存在着养殖环境恶化及水产致病菌严重等问题。笔者采用传统的TCBS培养基分离筛选菌株及分子鉴定方法，对该养殖区域的弧菌类群进行分析，探讨该养殖区潜在的弧菌病病原菌种类及其可能的风险。

1 材料与方法

1.1 样品采集 海水样品采集点位于福建漳州龙海紫泥围垦区养殖区域的01站位(117.908 916°E，24.448 861°N)，03站位(117.906 578°E，24.449 108°N)和06站位(117.907 878°E，24.446 680°N)，样品采集时间为2011年2月。

1.2 培养基 2216E和TCBS培养基(Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose)参考文献[6]中描述。

紫泥围垦区属于海水养殖区域，盐度相对较高，以TCBS培养基分离获取的菌株100%为弧菌，不包含有其他非弧菌TCBS类群，该结果与陈明霞等[6]、李和阳等[9]研究结果相符，TCBS培养类群中弧菌所占的比例与盐度息息相关。

翻模施工中，混凝土浇筑是最重要的环节。混凝土的拌和生产、浇筑等工序应由专人负责，浇筑前应认真检查模板，将模板表面清理干净，严格按照对称、均匀的原则进行混凝土浇筑。分层振捣，确保浇筑稳固。

选择坡度在30°以下的低丘缓坡地带，交通方便，土层深厚，具有良好光照条件，水源充足且灌溉方便的笋用林、笋竹两用林；如果选择材用林，必须经过3～4年的培育，达到笋用林标准后才能进行覆盖。林地区块自然分割，周边开沟贯通，排水通畅，每个区块面积最好不超过600 m2。起沟时，沿水平方向将泥土上翻，逐步垫高下坡位，减缓坡度；纵向水沟泥土也尽量翻至林地中间地带，累积加高林地中间地带，加厚土层，防止积水。林地周边有空地作堆场，便于存放覆盖材料。

1.4 弧菌的鉴定 对所分离得到的TCBS菌株进行16S rRNA基因-RFLP酶切谱型分析，挑选各RFLP谱型代表菌，通过16S rRNA基因序列比对及系统发育分析进行菌种分子鉴定，16S rRNA 基因的PCR扩增及酶切分析方法参考文献[7-8]中描述。菌株16S rRNA基因序列由南京金斯特生物技术有限公司测定，所得序列校正后在EzBioCloud数据库比对分析并获取相近菌种的16S rRNA基因序列。利用DNAman(version 5.1，Lynnon BioSoft)软件进行序列同源性分析及构建16S rRNA基因系统进化树。

2 结果与分析

2.2 弧菌16S rRNA基因序列及系统发育学分析 对6个代表菌株进行16S rRNA基因的序列比对鉴定(表1)及系统发育分析(图2)，6个菌株属于4种弧菌。Ⅰ型代表菌株JR-5和Ⅱ型代表菌株JR-12属于同一个物种(group 1)，与V.crassostreae LGP7T(大黄鱼弧菌)、V.celticus Rd 8.15T (凯尔特人弧菌)、V.gigantis CAIM 25T (牡蛎弧菌)的16S rRNA基因序列相似度皆为100.00%，无法区分，但从系统发育树上明显可见菌株JR-5、JR-12与V.crassostreae LGP7T距离更为接近，处在一个小分支上；Ⅲ型代表菌株JR-10和Ⅳ型代表菌株JR-19属于同一个物种(group 2)，与V.atlanticus Vb 11.11T (大西洋弧菌)、V.tasmaniensis LMG 21574T (塔斯马尼亚弧菌)皆有99%以上的同源性，但系统发育树分析显示菌株JR-10、JR-19与V.atlanticus Vb 11.11T具有更近的亲缘关系；Ⅴ型代表菌株JR-15与V.splendidus ATCC 33125T (灿烂弧菌)有99.85%的同源性，为group 3；VI型代表菌株JR-20与V.lentus 4OM4T (缓慢弧菌) 有98.60%的同源性，为group 4。不同弧菌类群所占比例不同，group 2 占有58.3%，具有绝对的优势，其他3类比例相当：group 1和4各占14.6%、group 3占12.5%。

注：M.DL 2000;1～15.紫泥围垦区06站位菌株编号 Note:M.DL2000;1～15.Strains numbers of station 06 of Zini marine aquaculture area 图1 部分弧菌菌株16S rRNA基因PCR扩增结果 Fig.1 16S rRNA gene PCR amplification results of some Vibrio strains

2.1 弧菌16S rRNA基因-RFLP分析 不同样品在TCBS培养基上生长的菌落皆属于典型的黄色或绿色，随机挑取48个菌落(尽可能包括所有不同菌落类型)，纯化后，使用细菌通用引物27F和1492R对所分离的48个菌株进行16S rRNA基因-PCR扩增(图1)，用Afa I和Msp I限制性内切酶对48个菌株16S rRNA基因扩增片段进行双酶切并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(RFLP分析)。结果表明，48个菌株可分为6种不同的RFLP分子谱型(Ⅰ～Ⅵ)，每种RFLP谱型挑出1个代表菌株进行16S rRNA基因的序列及系统发育学分析。

3 讨论

1.3 弧菌的分离培养 将01、03、06这3个站位的海水样品进行梯度稀释，得到100、10-1、10-2共3个样品梯度，每个梯度分别取200 μL于TCBS琼脂平板上，涂布均匀，于25 ℃培养箱培养；每个梯度做2个重复。随机挑取分离良好的48个菌落接种于2216E 琼脂平板上，尽可能保证挑取到所有的菌落类型。对所分离的菌株在2216E 平板上进行3次以上纯化，以保证得到纯培养物。

表1 不同RFLP谱型代表菌株16S rRNA基因序列系统关系分析结果

Table 1 Phylogenetic affiliations of 16S rRNA gene sequences of different RFLP type strains

RFLP分子谱型RFLPtype菌株Strains代表菌株Representa-tivestrain类别Group相似种及登录号Nearestspeciesandaccessionnumber同源性Identity∥%Ⅰ01站点:5JR-51VibriocrassostreaeLGP7(T)100Ⅱ01站点:9、11、1203站点:3、9、12JR-12CCJW01000022,V.celticusRd8.15(T)EF599162,V.gigantisCAIM25(T)EF094888Ⅲ01站点:2、4、6、7、10、23、39、4703站点:1、2、4、5、6、7、8、10JR-102V.atlanticusVb11.11(T)EF599163,V.tasmaniensisLMG21574(T)AJ51491299.84Ⅳ01站点:13、16、17、19、22、26、29、30、34、36、37、46JR-19—99.51Ⅴ01站点:15、18、21、24、3503站点:11JR-153V.splendidusATCC33125(T)X7472499.85VI01站点:8、20、23、27、31、39、47JR-204V.lentus4OM4(T)AJ27888198.60

注：结点处数字表示Bootstrap 1 000 次重复检验的自举值(仅显示高于50%的数值；括号中为每个16S rRNA基因序列的登录号；比例尺代表每100 bp 5个碱基替换数 Note:The bootstrap values above 50% from 1 000 replicates are shown.The accession number of each 16S rRNA gene sequence is given in parenthesis.The scale bar represents 5 substitutions per 100 bp 图2 根据16S rRNA基因序列构建的紫泥围垦区海水弧菌代表菌株系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree of representative Vibrio strains from Zini marine aquaculture area based on bacterial 16S rRNA gene

根据Drancourt 等[10-11]提出16S rRNA基因序列同源性鉴定规则及相关的系统进化树分析，紫泥围垦区主要的弧菌类群有4类，分别为group 1-V.crassostreae；group 2-V.atlanticus；group 3-V.splendidus和group 4-V.lentus。其中V.crassostreae和V.atlanticus至少含有2种类型的16S rRNA基因拷贝，因此具有2个的RFLP谱型。这4类弧菌都属于专性需盐细菌，是海水或咸水养殖水体的重要弧菌成员。

弧菌属包含100多个不同物种，分属于14个进化分支[12]，紫泥围垦区的4种弧菌类群皆属于V.splendidus进化分支[13-15]。V.splendidus可引起鱼类、对虾和牡蛎的疾病[5]；V.crassostreae于2004年分离自生病的长牡蛎(Crassostrea gigas)血淋巴[13]，是长牡蛎的条件致病菌[16]；V.atlanticus最早分离自海湾扇贝(Ruditapes philippinarum)[15]，目前并无实例证明该菌属于致病菌[12]，但其近似种V.tasmaniensis却被报道可以引起柳珊瑚疾病[17]；V.lentus可引起野生章鱼(Octopus vulgaris)疾病[18]，其对养殖生物同样具有严重威胁。

信息协调是基于BIM技术信息交互平台的建立而实现的。建筑施工过程中，工程任务量大、建设工期紧是其主要的特征所在；这对于建筑工程项目的部门沟通、专业沟通和节点沟通提出了较高要求。传统信息管理模式中，其信息交互的过程具有滞后性，繁琐的数据传达方式使得数据残缺、数据错误的现象广泛存在，其严重影响了工程建设的效率和质量。在BIM技术体系下，建设单位、施工单位、业主等信息交互方俱被纳入统一的管理平台，其实现了数据信息的高度共享与利用，有效的避免了信息沟通不到位而造成的施工质量问题。

据调查，许多养殖户会自购现成的TCBS培养基平板进行弧菌的分离培养，并通过观察菌落的颜色和数量以判断可能潜在的副溶血弧菌(V.parahemolyticus)病害危机，这显然并不科学而且经常会背道而驰。该研究明确了特定时间段内紫泥围垦区弧菌的类群组成，即该区域的弧菌主要为V.splendidus相关种类，对于针对性地防控这些弧菌引起的养殖动物疾病具有一定的指导价值。

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