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青藤碱对胶原诱导性关节炎小鼠肿瘤坏死因子-α、白介素-17及核因子-κB的影响

更新时间:2016-07-05

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜炎症为基本病理表现的自身免疫性疾病,可引起受累关节的肿胀疼痛、活动受限,炎症持续进展可造成对软骨及骨的破坏,造成关节畸形和功能丧失,具有高度的致残性。青藤碱(sinomenine,SIN)是从中药青风藤中提取的生物碱单体,药理研究发现其具有抗炎、免疫抑制等作用,对RA有较好的疗效[1]。胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型是目前公认的RA动物模型之一,本研究建立CIA小鼠模型,通过观察小鼠关节炎指数(arthritis index,AI)评分、血清炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)、滑膜核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)蛋白的变化及SIN的干预作用,以探索SIN治疗RA的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 DBA/1小鼠30只,6周龄,雄性,购于常州卡文斯实验动物有限公司,使用许可证:SCXK(苏)2011-0003。青藤碱(正清风痛宁片),湖南正清制药股份有限公司产品;牛Ⅱ 型胶原、完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA),美国Chondrex公司产品;小鼠TNF-α ELISA试剂盒,小鼠IL-17 ELISA试剂盒,深圳欣博盛生物科技有限公司产品;NF-κB p65抗体,英国Abcam公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 30只DBA/1小鼠用随机数字表法分成3组:即正常组、CIA组、SIN组,每组各10只,其中CIA组和SIN组的20只小鼠均先诱导建立CIA模型(正常组除外),在造模及给药过程中每组小鼠均有意外死亡,至最后实验数据统计,正常组剩余小鼠9只,CIA组9只,SIN组8只。

1.2.2 造模 参照文献[2]方法诱导建立CIA小鼠模型。将牛Ⅱ 型胶原与完全弗氏佐剂等体积研磨配置牛Ⅱ 型胶原乳剂,待乳剂乳化完全,于小鼠尾根部皮内免疫注射,分2次注射,每次各100 μL,初次免疫当天记为d 1,d21给予加强免疫注射。

1.2.3 关节炎指数评分 d 27开始根据各组小鼠关节肿胀情况进行AI评分,每周一次,评分标准[3]:0分,无关节肿胀;1分,足趾关节肿胀;2分,趾关节和足趾肿胀;3分,踝关节以下的足爪肿胀;4分,包括踝关节在内整个足爪严重红肿。各关节累计积分为各小鼠的AI评分,每只最高分为16分。

1.2.4 给药 d 28开始根据组别予不同处理,SIN组予每日青藤碱药液100 mg·kg-1灌胃,正常组及CIA组予生理盐水作为对照,连续给药20 d。

1.2.5 外周血采集及酶联免疫吸附测定(ELISA)

采取摘眼球法收集小鼠全血,静置离心,收集血清,放置-20 ℃储存备用。按照ELISA试剂盒说明书步骤检测血清TNF-α、IL-17水平。

1.2.6 滑膜采集及蛋白质印迹法(Western Blot) 处死小鼠后,仰卧位固定其头部和四肢,沿膝关节正中纵行切开皮肤,暴露膝关节中心约 3 cm × 3 cm的区域,用齿镊提起髌骨,剥离完整的膝关节滑膜组织,参照说明书提取滑膜蛋白,经电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育完成滑膜NF-κB蛋白检测。

1.3 统计学方法 本研究采用SPSS 22.0统计软件处理数据,计量资料以表示,多组间整体分析为单因素方差分析,组间多重比较,满足方差齐性检验者用SNK法比较,不满足方差齐性检验者用Dunnett T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠关节炎指数比较 造模d 24小鼠关节开始发红肿胀,关节炎发病,随着时间的延长,小鼠关节红肿情况加重,伴关节活动受限,无法承重。CIA组小鼠较正常组AI评分均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与CIA组比较,造模d 41和d 48,SIN组小鼠AI评分则明显下降,差异有统计学意义(d 41,P<0.01;d 48,P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠AI评分比较/(分,

组别鼠数d27d34d41d48正常组90000CIA组93.33±2.12a9.50±2.81a9.67±2.34a3.33±1.21aSIN组83.25±2.058.83±2.235.50±1.38b1.67±0.52cF值11.2118.3523.2820.80P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注:与正常组比较,aP<0.01;与CIA组比较,bP<0.01,cP<0.05

2.2 各组小鼠血清TNF-αIL-17及滑膜NF-κB蛋白比较 各组间血清TNF-α表达水平有明显差异,其中CIA组较正常组和SIN组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),SIN组TNF-α水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各组间血清IL-17表达水平有明显差异,其中CIA组较正常组和SIN组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),SIN组IL-17水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。各组间滑膜NF-κB蛋白表达差异显著,其中CIA组NF-κB蛋白表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01);SIN组NF-κB蛋白的表达显著下调,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

3 讨论

本实验采用DBA/1小鼠的CIA模型,系因CIA模型是研究RA最常用的模型之一,且其发病机制与RA有多方面的共同之处,包括滑膜增生、单核细胞浸润、软骨破坏等[2],DBA/1小鼠是诱导CIA模型的敏感种系,关节炎的发生率可达80%~100%,造模成功率高。本实验观察造模小鼠d 24关节炎开始发病,d 40左右关节肿胀达到高峰,本次造模的成功率为80%。SIN是从中药青风藤中提取的有效成分,研究发现,SIN可降低佐剂性关节炎大鼠的关节肿胀,降低关节炎大鼠的机械痛和热痛[4],并能降低CIA小鼠血清IL-1β、IL-6的水平[5]。本实验结果显示,造模d 27 CIA组小鼠的AI评分较正常组显著升高,d 28开始予SIN治疗2周后,SIN组小鼠的AI评分较CIA组明显降低,结果发现SIN能明显改善CIA小鼠的关节肿胀,对关节炎有较好的治疗作用。

表2 各组小鼠血清TNF-αIL-17及滑膜NF-κB蛋白比较

组别鼠数TNF-αIL-17NF-κB正常组9126.62±8.11347.60±14.660.17±0.02CIA组9347.97±13.45a621.78±48.96c0.84±0.04cSIN组8170.73±11.05b470.30±122.02b0.53±0.04bF值1 021.67184.42804.05P值<0.01<0.01<0.01

注:与正常组比较,aP<0.01,cP<0.05;与CIA组比较,bP<0.05

TNF-α是NF-κB活化后产生的重要炎症介质,具有广泛的生物学效应,其能诱导其他前炎症细胞因子如IL-1、IL-6的产生,促使趋化因子的释放,活化蛋白水解酶和金属蛋白酶,破坏关节软骨等,在RA关节炎中发挥重要作用[6-7]。IL-17是较晚发现的炎症细胞因子,有强大的致炎作用。IL-17在RA患者滑膜中表达水平升高,且会刺激多种趋化因子的表达,募集嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞至关节滑膜,加重关节炎症和损伤[8-9]。有研究发现SIN能下调血清IL-17的表达以改善CIA大鼠关节炎症[10]。NF-κB是广泛表达的核转录因子,在多种疾病的炎性位点高度活化,与关节炎的发生密切相关[11]。研究发现,NF-κB在CIA大鼠关节滑膜中的表达明显升高,NF-κB的活化能抑制RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的凋亡,促进RA-FLS相关细胞因子和蛋白酶的分泌[12]。口服NF-κB抑制剂咪唑啉可明显改善关节炎模型小鼠的关节炎症、血管翳形成、软骨损伤等症状[13]。本研究发现,CIA组小鼠血清TNF-α、IL-17及滑膜NF-κB蛋白的表达均明显升高(P<0.01或<0.05),与既往的研究结果一致,且SIN干预后,可显著抑制血清TNF-α、IL-17及滑膜NF-κB蛋白的表达(P<0.05),减轻CIA小鼠的关节炎症。

综上所述,本研究发现SIN可下调CIA小鼠滑膜NF-κB的表达,抑制血清TNF-α、IL-17的分泌,改善小鼠关节炎症,其可能是SIN治疗RA作用机制之一,为SIN治疗RA提供一定的实验依据。

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张玉萍,姚茹冰,赵智明,蔡辉
《安徽医药》 2018年第6期
《安徽医药》2018年第6期文献

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