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MED19基因对体内胃癌细胞增殖抑制作用机制的探讨△

更新时间:2016-07-05

中介体(mediator)最早发现于酵母菌中,是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物,属于RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分,在真核生物mRNA合成的活化和抑制中发挥关键作用[1]。酵母的中介体由25个亚基组成[2],其中21个亚基组成核心结构,包括头部、中部和尾部组件[3];4个亚基组成特别组件,对RNA聚合酶Ⅱ的活力进行调节。哺乳动物中介体的亚基组成及其相关活性已经确定,目前已鉴定30余种亚基,其中多数亚基与酵母的中介体亚基存在广泛的同源性[4-5]

MED19是中介体中的一个亚单位,又称肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis related protein 1,LCMR1),最初从高转移肺癌中克隆得到,已被证实参与细胞信号由胞外向胞内转导。抑制MED19基因表达,可引起某些调节细胞生长、分化和凋亡的基因的表达发生改变,提示MED19可能参与细胞的周期调控、信号转导或转录调控[6]。本研究利用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在离体胃癌SGC-7901组织细胞中沉默MED19基因,旨在观察其影响胃癌组织细胞增殖和细胞周期的能力,从而对MED19基因在胃癌中的功能进行验证。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立及瘤体获得

1.1.1 动物模型建立选择分化程度差且转移能力强的SGC7901胃癌细胞株(购自上海吉凯基因科技有限公司),经复苏及传代后置入培养瓶中备用。将SGC7901胃癌细胞分为3组:空白对照组,正常培养的SGC7901胃癌细胞,不用病毒颗粒转染;阴性对照组,用阴性对照病毒颗粒转染;病毒干扰组,用MED19 shRNA慢病毒颗粒转染。裸鼠为BALB/C-nu/nu裸鼠,共36只,鼠龄4~6周,雌雄各半,平均体重18~25 g,饲养于SPF级屏障动物实验室[SYXK(吉)2007-0011],喂养环境、温度、条件均符合实验要求。将裸鼠随机分成3组,每组12只,3组裸鼠的性别、鼠龄及体重比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。3组裸鼠分别以control组、negative组及shRNA组标记,按照组别将各组裸鼠分别移至超净台,用碘伏消毒待接种部位,混匀细胞悬液,选择裸鼠右侧腋下皮下为接种部位,分别抽取空白对照组、阴性对照组、病毒干扰组SGC7901细胞0.2 ml接种于control组、negative组及shRNA组裸鼠的接种部位,形成约3 mm皮丘,注射后局部压迫片刻。

1.1.2 获取动物模型肿瘤细胞每日观察裸鼠是否感染、出瘤时间、瘤体生长情况及肿瘤是否自然消退。成瘤的判断标准:肿瘤直径≥3 mm。全部成瘤率为83.3%。成瘤体积取平均值,每7天记录1组数值。全部裸鼠成活良好,肿瘤生长良好。成瘤35 d后,提取裸鼠胃癌组织SGC7901细胞,备下一步实验用。提取胃癌组织SGC7901细胞后全部裸鼠脱颈处死,沿肿瘤背膜完整剥离胃癌移植瘤备其他实验用。

1.2 慢病毒介导RNAi沉默MED19基因的效率验证

分别抽提3组裸鼠胃癌组织SGC7901细胞的总RNA,以β-actin为内参,采用蛋白质印迹法(Western blot)验证MED19蛋白表达水平的变化,采用实时聚合酶链反应(real-time PCR,RT-PCR)检测shRNA慢病毒对MED19 mRNA表达的抑制作用。

1.3 MTT法检测细胞增殖情况

RT-PCR检测结果显示:shRNA组裸鼠胃癌组织SGC7901细胞中MED19 mRNA的基因抑制率为79.3%(图1A)。Western blot检测结果显示:shRNA组裸鼠胃癌组织SGC7901细胞中MED19蛋白的表达水平为(0.23±0.11),低于negative组和control组的(1.03±0.21)、(0.95±0.13),差异均有统计学意义(P<0.05)(图1B)。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期

流式细胞术检测结果显示:shRNA组胃癌组织SGC-7901细胞的G1期细胞所占比例高于con-trol组和negative组,G2/M期细胞所占比例低于control组和negative组,差异均有统计学意义(P<0.05)。(表1)

2 结果

2.1 慢病毒介导MED19基因沉默效果的检验

分离3组裸鼠胃癌组织SGC7901细胞,取对数生长期的细胞进行接种,选取96孔板,每孔接种2000个细胞,每组5个复孔,接种5块复板。以波长570 nm处的吸光度值反映细胞增殖情况,细胞活力越强,OD570 nm值越大。连续检测5 d,以培养时间为横坐标,以OD570 nm值为纵坐标,绘制各组细胞的生长曲线。

图1 control组、negative组和shRNA组裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞中MED19 mRNA和蛋白的表达情况

注:A.RT-PCR检测MED19 mRNA表达情况;B.Western blot检测MED19蛋白表达结果

2.2 shRNA慢病毒介导MED19沉默对裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞增殖作用的影响

MTT法检测结果显示:不同时间点,control组和negative组裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞的增殖能力比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与control组和negative组相比,shRNA组裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞的增殖能力在第3~5天降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。(图2)

2.3 沉默MED19基因对裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞周期的影响

将3组裸鼠胃癌组织SGC7901细胞分别接种于6孔板中,先用胰蛋白酶消化,后进行细胞固定,待细胞未脱落呈圆形时,终止完全培养基。采用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤细胞,沉淀2次,2000 r/min离心5 min,收集细胞,然后加入70%的冰冷乙醇1 ml固定细胞,调整温度至4℃,摇床振荡过夜培养。此后,采用冰PBS再次洗涤细胞2次,2000 r/min,离心5 min,收集细胞。1 ml冰PBS溶液重悬细胞沉淀,随后在P(I1∶40)及RNase(1∶100)中分别将其加入,冰浴15 min,并应避光进行,上机进行流式检测。

胃癌是人类较常见的胃肠道恶性肿瘤之一。据流行病学调查结果显示,在世界范围内,因胃癌导致死亡的概率在恶性肿瘤中居第2位,目前发现中国、日本等国家占有全球约60%的胃癌新发病例[7]。目前,针对胃癌的治疗,外科手术仍然是最有效的方式,但是近年来的统计数据显示,胃癌患者术后5年的生存率仍然较低。2009年统计结果显示,胃癌患者术后5年的总体生存率低于25%[7]。从分子生物学的角度考虑,胃癌的发生过程是一个多步骤、多阶段的效应过程,主要以癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活为基础,通过癌基因和(或)抑癌基因表达产物的改变,导致细胞出现如恶性增殖、去分化和侵袭性生长等特征,导致癌变的发生。因此,基于上述理论,设想如果能实现对这一主要基础变化的控制,即对癌基因激活和(或)抑癌基因失活的控制,就能够使肿瘤的发生被阻断。这也是近年来胃癌治疗领域的主要研究目标。RNAi技术具有高效性、特异性和低毒性等特点,使得该技术自应用以来在反向基因组学、基因治疗、抗肿瘤、抗病毒、抗遗传性疾病以及胚胎干细胞的研究等多项研究中显示出了巨大的潜力[8-9]

今年,二二三团广泛开展文明创建活动、培育各族职工群众健康文明生活方式,营造良好的社会风尚。通过召开群众大会、书写宣传标语、印发宣传资料、组织专题培训等,不断提高群众的知晓率、参与率和支持率。同时,连队“两委”班子成员和驻连工作队员不定期开展环境卫生和文明行为检查,对检查结果进行公示,并督导职工群众进行整改。

图2 不同时间点control组、negative组和shRNA组裸鼠胃癌组织SGC-7901细胞的增殖情况

注:a与control组比较,P<0.05;b与negative组比较,P<0.05

表1 control组、negative组和shRNA组不同细胞周期胃癌组织SGC-7901细胞所占比例的比较(%,±s

注:a与control组比较,P<0.05;b与negative组比较,P<0.05

组别control组negative组shRNA组G1期56.0±0.8 58.2±0.7 71.2±0.8a b G2/M期15.0±0.9 15.0±0.7 7.5±0.7a b S期28.9±0.8 26.7±0.9 21.3±0.3

3 讨论

流坑村西南方向区域,古建筑较稀少,建议政府出台更多优惠政策,鼓励居民搬离古建筑区,整体迁入新居住区,将古建筑区集中进行围栏式保护。流坑古建筑群是由重要建筑和周边的非重点建筑组成的整体,都是古村文化的组成部分,因此在不改变原有结构前提下应对流坑古村实行整体性保护,并突出重点,对重点建筑集中区开设参观路线,适当进行功能置换,如改造成历史博物馆,对外展示古村的历史文化资源。

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MED19基因是在对CYC7基因突变进行观察时发现的[10]。相关研究证实,中介体和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亚基是MED19基因所编码的产物[11]。而酵母RNA聚合酶Ⅱ的头部组件是由MED19/ROX3构成的[12-13]。当MED19/ROX3片段缺失后,中介体中部组建的解离情况出现,仅保留了由头部和尾部模块组成的亚复合体,这也提示了中部组件在中介体的位置,MED19基因对其起到了稳定作用,而不会影响头部和尾部组件。另一研究证实,MED19/ROX3突变后,MED19/ROX3中介体对RNA聚合酶Ⅱ的亲和力明显下降,无法刺激RNA聚合酶Ⅱ亚基羟基端结构域,导致其磷酸化[14]。还有研究表明,MED19基因被确定为沉默转录因子RE1操纵的调控装置的重要组分[15]

目前,还在不断完善和研究关于MED19基因在肿瘤组织中的特性,本研究组的前期研究已经证实了MED19基因在胃癌组织中的特性问题,并且也已经进行了详细阐述,研究证实MED19基因在肿瘤组织中的高表达具有特异性,这是通过免疫组化方法实现的,观察并证实MED19基因的表达上调可能与胃癌的发生存在一定的关联性。但该研究尚未阐明MED19基因对细胞增殖和细胞周期的影响[16]。本研究采用RNAi技术对MED19基因进行沉默后,通过一系列实验及方法对胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力的变化进行了观察,MTT法检测结果表明,与control组和negative组相比,shRNA组胃癌组织SGC-7901细胞的增殖能力在第3~5天降低(P<0.05),说明对照序列的慢病毒,也可以说慢病毒本身对SGC-7901细胞增殖能力并没有影响,而MED19基因沉默因shRNA慢病毒的介导而导致了SGC-7901细胞中细胞增殖能力下降。流式细胞仪检测细胞周期变化显示,与control组和negative组相比,shRNA组胃癌组织SGC-7901细胞的细胞周期阻滞于G1期,使细胞复制能力明显降低,这也验证了MED19基因的表达可以起到对胃癌细胞增殖的促进作用。在利用MGC803细胞进行的体外实验中,同样也得到了如上所述的结论[17]

睡眠障碍与动脉硬化存在着密切的联系,尤其表现在心血管、脑动脉、劲动脉、周围动脉中。但关于这两者究竟是如何互相影响的,目前尚没有权威论证,所以还有待更多的学者的研究,以求取得突破性的近战。对于睡眠障碍与动脉硬化的中医证型分析更是一个新颖的探索课题,未来可以结合中医脉象、中医舌诊等方面应用现代医学的研究方法,通过大样本的临床调查、前瞻性研究和回顾性研究相结合,获取确凿、充分的临床证据。通过中医证型的确定,可以更及时的对动脉硬化与睡眠障碍患者进行筛查、干预治疗,改善愈后,提高生存率,体现中医治未病理念。

综上所述,沉默胃癌细胞MED19基因,能够对胃癌细胞的恶性表征起到有效地抑制作用,MED19基因在胃癌的靶向治疗和基因治疗中,很可能成为有效的靶点,但这还有待进一步研究证实,具有良好的应用前景。

参考文献

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[17]丁相福,李俊安,宋彬,等.Med19基因沉默对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响[J].中国老年学杂志,2010,30(8):1112-1115.

丁相福,王婷婷,许崴崴,袁伟杰,徐广甍,魏士雄
《癌症进展》 2018年第9期
《癌症进展》2018年第9期文献

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