0　引言

青光眼以特征性的视野缺损和眼底视神经受损为临床表现，是全球第一大不可逆的致盲性眼病。病理性高眼压是原发性开角型青光眼的高危因素，与房水流出密切相关。其中小梁网组织作为房水外流经过的首个通道和产生阻力的主要部位[1]，对眼压调控有重要的影响。

用银勺取少量上述掺假油样品，放置于显微共焦拉曼光谱仪的实验平台上，并使激发光的光斑聚焦到微米量级，进而对样品的微区进行精确分析。实验采用785nm的半导体激发光源，物镜为20 倍长焦距镜头，波数范围为90～3 500cm-1，分辨率为9cm-1，扫描3次取平均，每次积分时间为3s，并且每个掺假油样品测5次。纯芝麻油样品拉曼光谱图如图1所示。

由于小梁网组织的特殊结构，小梁网细胞除受到静水压力和房水产生的剪切力作用外，在眼压变化时还受到拉伸等生物力的作用。小梁网细胞作为一种力学敏感型细胞，可以通过膜上的力学感受器感知眼压升高，从而调整细胞状态和房水阻力，维持正常眼压[2-3]。已有证据表明静态或循环的机械牵张会显著影响小梁网细胞中细胞外基质调控基因、细胞骨架调控基因、信号转导基因、压力响应基因的表达[4-5]，并且通过基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等和多个信号通路来调整细胞外基质的成分和结构[6-7]。还有研究者发现静态双轴拉伸会激活小梁网细胞的自噬行为，并认为这是细胞在应激状态下为了适应环境，保持细胞内稳态的必要行为[8]。这些研究表明力学作用确实使小梁网细胞产生了各个方面的生物学改变，然而蛋白质作为生命活动的最终执行者，尚无人研究过整体水平上即蛋白组学的表达变化。

因此，本文中采用快速、灵敏度高、动态监测范围广的鸟枪法定量蛋白质组学技术，分别对循环机械牵张下和不加力培养的大鼠小梁网细胞的蛋白质进行鉴定，通过对比分析和生物信息学分析筛选出更具有生物意义的差异蛋白，旨在对蛋白水平上的应答保护和眼压调控机制有更深入的认识。

1　材料和方法

1.1　细胞培养和力学加载

从江阴齐氏生物科技有限公司购买大鼠小梁网原代细胞后，用含10%胎牛血清的完全培养基传代培养。选用第三代至第六代间状态良好的细胞接种至BioFlex应力培养六孔板(美国Flexcell公司)，汇合至80%时更换为含2%血清的培养基，采用FX-5000牵张应力加载系统(美国Flexcell公司)拉伸细胞。实验条件为：拉伸幅度15%，频率1 Hz，时间24 h。对照组不施加力学刺激，其他条件和实验组均相同。每组设置3个样本，共计6个样本。

1.2　细胞的全蛋白提取

陈辉[34]指出，碑与帖，书法风格面目不同，它们的功用也不同。碑刻是严肃的事情，所以书法多朴厚庄重，而帖书多为信札随笔，所以无拘无束，挥洒自然。具体说来，它们的区别有以下4个方面：①制作目的不同，②形制不同，③书体不同，④制作方法不同。

1.3　样品的质谱测试和蛋白质鉴定

将各个蛋白样品置于37 ℃环境下变性4 h后冷却离心，吸取上清至30 kD超滤管中，经透析纯化后，按蛋白质与胰酶质量100∶1的比例加入胰酶，放入37 ℃恒温箱酶切反应过夜，次日测定肽段浓度。将EASY-nLC 1000高效液相色谱仪与Q-Exactive HF质谱仪和Easy Spray Ion Source User Guide电喷雾离子源(均为美国Thermo Scientific公司)相连用以分析样品。肽段混合物进行线性梯度分离后进入一级质谱分析。设定质谱仪扫描范围为350～1 400 m/z，选择其中丰度最强的前20个离子进行二级质谱分析。经质谱测试得到的数据采用Proteome Discoverer 2.1(美国Thermo Scientific公司)处理分析，得到蛋白质的鉴定结果。

1.4　差异蛋白的统计学分析

质谱测试后共鉴定出3 727种蛋白质，对两组6个样本的蛋白表达量进行SAM分析后，取Δ=1.72，此时FDR < 0.1。SAM方法的分析结果如图1，其中黑点表示无差异的蛋白点，红点表示表达上调的蛋白点，绿点表示表达下调的蛋白点。在结合q-value < 0.05的标准下最终共筛选出57个差异显著的蛋白，均表达上调。

全球超过90%的人群在一生中都保持着正常眼压水平，这表示小梁网处存在着高效的维持眼压稳态的机制[10]。高眼压或力学刺激可通过影响小梁网细胞老化、细胞骨架成分、细胞外基质成分和氧化应激反应来调节房水外流阻力[11]。从本研究差异蛋白的功能注释可以看出，机械牵张对大鼠小梁网细胞的蛋白质表达影响范围广，过程复杂。这提示小梁网细胞在眼压升高时有一套复杂的蛋白水平的应答机制，以此来实现自我保护和维持眼压稳态。

1.5　差异蛋白的生物信息学分析

利用生物信息学分析的在线工具PANTHER(http://www.pantherdb.org/)进行基于Gene Ontology(GO)的蛋白质的功能注释，并利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析。

对差异蛋白功能注释后，利用在线工具DAVID 6.8对它们进行超几何分布的蛋白质功能富集。生物学过程的富集结果表明，在校正P值 < 0.05的情况下，57个差异蛋白中有24个显著富集在了9个隶属生物学过程的GO term中(如图3)。进一步进行KEGG通路富集后，发现它们主要参与两个通路：核糖体通路(rno03010)和内质网蛋白质加工通路(rno04141)。本研究把重点关注在GO和KEGG通路中均有富集的蛋白质，如表1所示。

2　结果

2.1　差异蛋白质的筛选结果

两组蛋白质表达谱的差异分析采用微阵列显著性分析方法(significance analysis of microarray,SAM)[9]，它以t检验为基础，根据排列组合的原理计算检验统计量的理论分布，通过调整统计量测量值di和期望值的差值来控制FDR。

图1　SAM的计算结果 Figure 1　Calculation results of SAM

2.2　基于GO的功能注释结果

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一类广泛存在于生物体中的保护性蛋白，可由高温环境或其他物理、化学刺激诱导而大量产生。它们可以阻止危害细胞健康的蛋白之间相互作用，促进有利于健康的蛋白生成以及参与免疫应答过程，从而帮助细胞维持正常的生理活动。HSPs在肿瘤中所起的重要作用已成为近年来的研究热点。很多学者也在寻找HSPs与青光眼的关系。由于细胞自噬已经成为公认的小梁网细胞对力学刺激的应激反应[13]，而HSPs可以作为分子伴侣参与自噬，这也部分解释了本研究中机械牵张导致小梁网细胞HSPs发生显著上调的原因。此外，研究表明HSP 72可以提高大鼠慢性青光眼模型中视神经节细胞的存活率，对视神经具有保护作用[14]。Sacca等[15]发现HSP 60和HSP 90在青光眼患者中表达明显增加。还有一些报道证实了小梁网细胞中HSPs参与某些信号通路，以此来调整细胞骨架和细胞结构[16]。这均为它在本研究中的表达上调提供了合理的解释依据，表明HSPs是眼压升高时参与小梁网细胞应答的重要蛋白。它们在帮助细胞提高应激能力，调整细胞骨架和适应高眼压环境等方面发挥了关键作用，很有可能成为潜在的房水流出通路失调的病理影响因素。

拉伸实验结束后，将各组细胞消化离心得到细胞沉淀，使用RIPA裂解液(美国Thermo Scientific公司)提取蛋白，蛋白酶抑制剂现配现用(瑞士Roche公司)，用BCA法测定蛋白浓度。

2.3　基于GO的功能富集和KEGG通路富集结果

阅读理解：在平面直角坐标系中，若两点P、Q的坐标分别是P(x1,y1)、Q(x2,y2)，则P、Q两点间的距离为如P(1，2)，Q(3，4)，则对于某种几何图形给出如下定义：符合一定条件的动点形成的图形，叫做符合这个条件的点的轨迹．如平面内到线段两个端点距离相等的点的轨迹是这条线段的垂直平分线．

3　讨论与结论

本研究对两组蛋白表达谱进行两类非配对的SAM分析，设置重排次数为100次，随机种子数为100，差异蛋白质筛选标准为FDR<0.1，且q-value<0.05。整个过程均利用R软件(http://www.r-project.org)samr安装包实现。

差异蛋白质组学和生物信息学方法常结合使用以实现各种疾病标志物的筛选，及解释细胞在各种不同因素下的生理和病理机制[12]。蛋白质组学手段多样，本文采用的基于鸟枪法的质谱技术，可同时鉴定上千种蛋白质。为了蛋白质的准确鉴定，选择得分高于10，最多两漏切位点被允许，且最小长度为7个氨基酸的肽段作为有效鉴定肽段。在寻找差异蛋白时将FDR控制在0.1以内，并保证每个差异蛋白q-value < 0.05。最后，为了找出对实验条件最为敏感的、更具有生物意义的蛋白质，对差异蛋白进行了GO富集和KEGG通路富集，发现了以下两类蛋白质显著富集在内质网蛋白加工通路和核糖体通路中。

对于SAM分析得到的这57个蛋白质，运用GO在线工具对它们分别进行功能注释和Level 2水平上的统计。结果显示如图2，生物学过程方面有7个蛋白参与细胞成分组织和生物合成，23个蛋白参与细胞过程，3个蛋白参与细胞定位，6个蛋白参与生物学调控，9个蛋白参与刺激反应，5个蛋白参与细胞发育过程，1个蛋白参与生物学黏附，22个蛋白参加细胞代谢过程，2个蛋白参与免疫系统过程。细胞组件方面有3个蛋白属于膜成分，17个蛋白属于高分子化合物，25个蛋白属于细胞部分，21个蛋白属于细胞器，1个蛋白属于细胞外区域。分子功能方面有15个蛋白具有结合功能，11个蛋白具有结构分子活性，10个蛋白具有催化活性，1个蛋白具有抗氧化活性，2个蛋白具有转运活性。

汞的毒性很大，对人类健康造成极大危害。日本、加拿大、挪威、伊拉克和美国等国都曾发生过汞中毒事件，例如在1953—1960年期间，日本水俣市发生了汞中毒而引起的疾病——水俣病，从而引起了世人的关注[19]。

图2　基于GO注释的差异蛋白分类的统计结果 Figure 2　Statistical results of classification of differential proteins based on GO annotation

图3　差异蛋白的生物学过程富集结果 Figure 3　Biological process enrichment of differential proteins

表1　24个富集在显著GO条目和KEGG通路的差异表达蛋白描述 Table 1　Description of 24 differentially expressed protein in significant GO terms and KEGG pathways

蛋白质AC号蛋白质名称富集在的GO号富集在的KEGG通路P2404960SribosomalproteinL17GO：0006412rno03010核糖体D3ZM33RibosomalproteinS18⁃likeGO：0006413D3ZZK1RibosomalproteinS20⁃likeGO：0006414P6285940SribosomalproteinS28GO：0006415rno03010核糖体P4112360SribosomalproteinL13GO：0006416rno03010核糖体P2335860SribosomalproteinL12GO：0006417rno03010核糖体P6225040SribosomalproteinS16GO：0006418rno03010核糖体P6290940SribosomalproteinS3GO：0006419rno03010核糖体Q6PDV8RCG31311GO：0006420P6290760SribosomalproteinL10aGO：0006421rno03010核糖体Q5BJN740SribosomalproteinS30GO：0006422rno03010核糖体Q7TPB1T⁃complexprotein1subunitdeltaGO：0006457，GO：0051085P63018Heatshockcognate71kDaproteinGO：0006457，GO：0061077，GO：0061741，GO：0061684，GO：0061635，GO：0051085rno04141内质网蛋白加工P34058HeatshockproteinHSP90⁃betaGO：0006457，GO：0061741，GO：0061684，GO：0061635，GO：0006950rno04141内质网蛋白加工P82995HeatshockproteinHSP90⁃alphaGO：0006457，GO：0061741，GO：0061684，GO：0061635，GO：0006950rno04141内质网蛋白加工P52555Endoplasmicreticulumresidentprotein29GO：0006457，GO：0034976rno04141内质网蛋白加工Q66HD0EndoplasminGO：0006457，GO：0006950rno04141内质网蛋白加工Q6DGG0Peptidyl⁃prolylcis⁃transisomeraseDGO：0061077，GO：0006457P24368Peptidyl⁃prolylcis⁃transisomeraseBGO：0061077D4A4T9Cysteineandhistidine⁃richdomain⁃containingprotein1GO：0061077G3V6T7Proteindisulfide⁃isomeraseA4GO：0061077，GO：0034976rno04141内质网蛋白加工Q66HA8Heatshockprotein105kDaGO：0051085rno04141内质网蛋白加工P04785Proteindisulfide⁃isomeraseGO：0034976rno04141内质网蛋白加工P55062Baxinhibitor1GO：0034976

核糖体蛋白(ribosomal proteins, RPs)是人体内合成蛋白质的主要成员，同时具有调控细胞发育、促进血管生成等广泛的核糖体外功能。大量研究证实了多种RPs在肿瘤、先天性贫血、生长发育不全的过程中有异常表达[17-18]，并发挥广泛作用。其在小梁网上的表达及其对小梁网功能的影响鲜有报道，猜测RPs的高表达与力学刺激下细胞周期和凋亡的调控密切相关，进一步的研究可能为揭示青光眼的发病机制提供新线索。

综上所述，本研究筛选出了小梁网细胞在机械牵张作用下表达显著增加的两类蛋白质，它们的主要功能是参与细胞的应激反应和维持细胞内稳态过程，与蛋白质的损伤修复密切相关。这些发现能够引导研究者深入认识眼压调控的机制，然而受限于蛋白质组学技术对样本的高要求和高昂的分析成本，本研究只采用了6个样本(对照组和实验组各3个样本)。因此在以后的研究中，还须采用多层次和多角度的实验进行验证，从而为青光眼的早期诊断和治疗提供更有力的理论和实验基础。

省民族宗教委党组召开巡视整改专题民主生活会 10月23日，省民族宗教委党组召开巡视整改专题民主生活会。会议以“深入学习贯彻习近平总书记关于巡视工作重要讲话精神、认真做好巡视整改”为主题，重点对照省委第十巡视组巡视反馈指出的问题，结合思想和工作实际，进行党性分析，开展批评与自我批评，明确整改方向和整改措施，抓好整改落实，确保巡视整改工作取得实效。

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