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鸡柔嫩艾美尔球虫对免疫细胞体外增殖及产生的免疫相关分子的影响

更新时间:2016-07-05

鸡球虫病是由一种或多种艾美尔属的球虫寄生在鸡肠上皮细胞引发的一种原虫病,主要威胁10~30日龄的雏鸡或35~60日龄的青年鸡。鸡只球虫感染后,病鸡出现精神沉郁、食欲不振、生产性能下降,严重者肠道内出血和出现血便,引起鸡只死亡[1]。鸡球虫发育经历三个阶段,即无性生殖阶段、有性生殖阶段、孢子生殖阶段,其中孢子生殖是球虫发育史中关键的一步,含有成熟子孢子的卵囊即感染性卵囊具有感染性。早在1970年就有人提出子孢子的免疫原性[2],Jenkins等对子孢子进行了鉴定,发现子孢子中含40多个主要抗原成分[3]

球虫感染过程中免疫细胞参与相关免疫反应,巨噬细胞监测、吞噬溶解病原并将抗原信息传递给T细胞,启动细胞免疫应答反应[4]。T细胞是作为效应细胞释放某种介质,介导细胞发挥免疫调节作用。倪风娥[5]等研究发现,机体对球虫感染具有T细胞应答,其数量的变化趋势与球虫体内的发育过程密切相关,T细胞可能对机体在抵抗球虫免疫的整个过程都有重要作用[6]。巨噬细胞由骨髓造血干细胞分化发育而来,是机体抵抗病原体的第一道防线,吞噬和杀灭感染初期入侵病原。研究报道,球虫感染后巨噬细胞内存在大量子孢子,但只有在T淋巴细胞激活后,在补体系统帮助下巨噬细胞吞噬功能增强,从而消化溶解子孢子,也可通过释放不同的细胞因子,调节细胞免疫[7]。研究发现,鸡只感染球虫后,感染鸡的脾脏巨噬细胞迅速释放肿瘤坏死因子(TNF),从而激活T、B淋巴细胞,呈现细胞免疫和体液免疫;同时也可吸引吞噬细胞到感染部位发挥吞噬作用。细胞因子是指免疫细胞经刺激后合成分泌的一类多肽或蛋白质,主要有白细胞介素(IL)、TNF-α、干扰素(IFN)等,它们在免疫细胞的分化、免疫应答,及参与组织修复等过程中起着重要的调节作用[8]。黄静[9]采用ELISA法检测囊虫病患者血清中TNFα、IL-6、IL-8等,结果感染囊虫患者血清中细胞因子的含量有所升高。

本研究拟以免疫细胞为研究对象,鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子体外刺激免疫细胞共培养,通过免疫学及流式细胞技术等分析细胞增殖及免疫相关分子,探明鸡柔嫩艾美尔球虫对免疫细胞功能的影响,为鸡柔嫩艾美尔球虫感染防治提供依据。

1 材料与方法

1.1

鸡柔嫩艾美尔球虫病原卵囊子孢子由北京农学院球虫实验室提供,鸡HD11巨噬细胞系由北京农学院奶牛营养实验室惠赠。红细胞裂解液、淋巴细胞分离液购于Solarbio公司,噻唑蓝(MTT)、刀豆蛋白(ConA)购于美国Sigma公司,RPMI1640高糖培养基购于美国HyClone公司,胎牛血清购于法国Biowest公司,白细胞介素2(IL-2)试剂盒、干扰素-γ(IFN-γ)试剂盒、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。FITC标记的MHC-Ⅱ、PE标记的KUL01购于abcam公司,TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 购自北京艾德莱生物科技有限公司,SYBR© Premix Ex TaqTM(Tli RnaseH Plus)(RR420A)购自日本TaKaRa公司,所用引物由华大科技公司合成。

食醋酿造中需要加入大量的填充料,它的作用在于疏松醋醅、储存大量空气和空气流通。填充料的存在为醋酸菌细胞的生长提供了吸附载体,为醋酸菌提供了好氧发酵的环境。所以,填充料要求接触面积大,其纤维质具有适当的硬度及惰性。常用的填充料有:谷糠、高粱秸秆、玉米秸秆、玉米芯、多空玻璃纤维等。

1.2

1.2.1 免疫细胞分离培养与分组 雏鸡翅静脉采血1 mL与等体积PBS溶液混匀,缓慢加入到含有2 mL T淋巴细胞分离液的离心管中,2 000 r/min离心20 min;吸出白雾状的淋巴细胞,与适量PBS中混匀2 000 r/min离心10 min;弃上清然后加红细胞裂解液,离心除去红细胞,RPMI1640完全培养基重悬T淋巴细胞并计数。

无菌操作取出鸡脾脏,剪碎后在孔径0.075 mm细胞筛上研磨,收集细胞液离心,重悬细胞并加红细胞裂解液除去红细胞, RPMI1640完全培养基重悬脾细胞并计数,然后置于细胞培养板,加ConA 使其终浓度为5 μg/mL,培养板置于37 ℃ 5% CO2培养24 h,收集T淋巴细胞备用。

[6] 曾智勇,杨光友,梁海英.鸡球虫病保护性免疫机理探讨[J].中国家禽学报,2003,7(1):139-141

高中数学教学当中对微课的运用要充分注重要点的把握,每个环节对最终的数学教学效果都会产生影响,所以要充分把握微课应用要点.加强微课的应用质量,在选题研究方面要充分重视,由于高中数学教学中并不是每个数学知识点都需要或者是适合采用微课的方式,这就要求在数学教学的选题研究环节加强重视,将教学当中的难点以及要点和适合采用微课的方式要素进行结合,制定规范的课件内容,避免课件制作的复杂,要尽量的简单明了方便学生理解.

复苏HD11巨噬细胞于37 ℃ 5% CO2培养至对数生长期,收集细胞并计数备用。

2018年6月11日稗草1-3叶期,将4%氟嘧啶草醚+2.5%五氟磺草胺可分散油悬浮剂100毫升/亩。甩施,施药后保持水层3-5厘米7天以上,田间管理同一般生产田。

试验分组设对照组和子孢子组,对照组细胞用完全培养基、子孢子组细胞用完全培养基和3×105个/mL子孢子共培养,然后加入细胞培养板置于37 ℃ 5% CO2培养24 h。所有试验重复3次,每次试验每组设4个平行重复。

1.2.2 细胞增殖检测 按试验分组淋巴细胞和巨噬细胞培养24 h后,每孔细胞加入8 μL MTT,37 ℃避光培养4 h后弃去上清液,每孔加入100 μL DMSO,振荡10 min,酶标仪检测570 nm处吸光度值。

对于中小股东,一方面应在行权方式上进行创新。推行中小股东的代表制度,对股权代表赋予相应的经营权限。经推选的股权代表允许进入董事会,反映中小股东提出的相应问题,来最大程度的维护中小股东的权益;另一方面要完善农商行内部员工的持股机制。在坚持公平、自愿的前提下,要构建以公会为中心的持股会,通过科学流程来选取股权代表,参与农商行的治理及运行,成为维护中小股东利益的一张“名牌”。

1.2.3 Griess法检测淋巴细胞分泌NO 免疫细胞培养24 h后每孔取100 μL上清液移至酶标板中,加入100 μL Griess试剂,室温反应10 min,测定490 nm处的吸光值,根据NaNO2标准曲线计算NO量。

1.2.4 ELISA法检测细胞分泌细胞因子 取各组上清液,按试剂盒IL-2和IFN-γ及iNOS说明书,分别检测450 nm波长吸光度值,计算其含量。

1.2.5 中性红法检测HD11细胞吞噬功能 试验各组弃培养基,每孔加入100 μL 0.075%中性红,继续培养24 h后弃培养基,PBS洗涤,每孔加100 μL细胞裂解液,检测540 nm处吸光度值。

1.2.6 流式细胞术检测HD11细胞表面分子 胰酶消化收集巨噬细胞,预冷PBS洗涤,收集细胞计数,加入流式管1×105细胞/管,加KUL01-PE和MHC-Ⅱ-FITC标记抗体,4 ℃避光孵育30 min, PBS洗涤后采用流式细胞仪检测。

研究认为淋巴细胞的增殖能力间接反映机体免疫功能情况,特定条件下淋巴细胞的活化及分化是机体的免疫应答能力增强的具体体现。刘光辉等研究探讨鸡只抵抗球虫的免疫力,试验首先分别鸡摘除胸腺和法氏囊,然后使其感染球虫,结果表明T细胞介导的细胞免疫在抵抗球虫感染中占有核心地位[10] 。NO作为机体细胞功能的信使分子和效应分子起着非常重要的作用,许多试验结果表明NO在寄生虫感染的免疫过程中发挥着一定的作用[11]。本试验鸡柔嫩艾美尔球虫体外刺激免疫细胞培养24 h,采用MTT法检测外周血和脾中T淋巴细胞的增殖,结果子孢子刺激外周血和脾T淋巴细胞后其增殖明显,子孢子刺激的HD11巨噬细胞、外周血淋巴细胞分泌NO量增加,且其基因表达上调。研究结果与前人报道一致。

改革开放之初的1978年,哈电电机的主要产品产量150万千瓦,而到了该公司历史最高峰的2008年,该公司综合产品产量达到了3510万千瓦,是改革开放初年的23.4倍,为当年世界第一。作为共和国电力装备骨干企业,哈电电机推动中国发电设备登上了世界行业之巅。

(1) 细胞总RNA的提取。首先弃孔内培养基,预温PBS洗,弃PBS后每孔加入1 mL Trizol,静置5 min收集细胞于EP管,向其加0.2 mL氯仿剧烈震荡15 s,静置3 min,4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,吸上层透明水相于EP管后加0.5 mL异丙醇,轻轻混匀室温静置10 min,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,弃上清用1 mL 75% 乙醇(DEPC水配制)洗,4 ℃ 12 000 r/min 离心,弃上清后加10 μL DEPC水溶解RNA,混匀后用核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和OD 260/280,-80 ℃保存备用。

(2)引物的合成及反转录。引物根据GenBank中的序列用Primer5.0软件设计,见表1。取PCR管置于冰上,分别加入RNA模板3 μL、Oligo(dT)18 1 μL、Rtase 0.8 μL、5xRTRraction Mix 4 μL、Rnase free H2O 补齐20 μL,混匀后离心,置于PCR仪,PCR反转录反应条件为:42 ℃ 50 min、65 ℃ 15 min、4 ℃ 维持,反应结束后得第一链产物cDNA,-80 ℃ 保存备用。

在本实验中仍然存在一定的局限性。输血患者减少的比例差异无统计学意义。虽然氨甲环酸组的患者比对照组接受输血的人数少,但是差异无统计学意义,这可能与样本量较少有关。其次,术中失血量的评估,并未将手术衣、铺巾上的失血算入,这可能导致误差。而氨甲环酸药物的使用剂量仍然是基于大部分脊柱外科推荐剂量使用,而具体氨甲环酸在肿瘤手术中的最佳剂量仍然需要大量的不同实验去验证。最后,两组患者术后的引流量的比较差异无统计学意义,可能与术后未使用氨甲环酸,患者血液中氨甲环酸浓度下降,而未发挥药物作用有关。

表1 SYBR Real-Time PCR 反应引物序列 Tab.1 the primer sequences of SYBR Real-Time PCR reaction

基因Gene引物序列SequencesoftheprimerGADPHF:5’-GCCTTCCGTGTTCCTACC-3’R:5’-CTTCACCACCTTCTTGATGT-3’IL-2F:5’-TTTGGCTGTATTTCGGTAG-3’R:5’-CTGGGTCTCAGTTGGTGT-3’IFN-γF:5’-ACAGCCAACGCCAAAGCCT-3’R:5’-GAGGTGAAGGTTGCGAGGC-3’iNOSF:5’-CAGTGGTAAACTACAGGACAAGAGA-3’R:5’-CAAAGCACGGGACTGTTTCATT-3’

第三就要鼓励创新,在农机化技术优化的同时实现农业生产机制完善,提高农机技术的利用效率与效益。争取做到以省内各个地区的龙头农业企业为核心,带动搭建农机化科研研发创新平台,不断提高农业机械化技术的研发能力与制造水平。

1.2.8 统计分析 试验结果以平均数±标准差表示,采用t 检验, *P<0.05为差异显著,**P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 鸡柔嫩艾美尔球虫对免疫细胞增殖的影响

MTT检测细胞增殖,结果子孢子组的鸡巨噬细胞系HD11巨噬细胞吸光度值显著低于对照组,外周血淋巴细胞的吸光度值差异显著高于对照组,脾淋巴细胞的吸光度值增加,与对照组差异显著(图1)。

A.HD11巨噬细胞;B.T淋巴细胞 A.means HD11macrophage;B.means T lymphocyte 图1 鸡球虫对免疫细胞增殖的影响 Fig.1 Effectsof chicken coccidian on the proliferation of immune cells

2.2 鸡柔嫩艾美尔球虫对免疫细胞分泌NO及iNOS mRNA表达的影响

通过Griess法检测细胞分泌NO,结果与对照组相比,球虫子孢子组HD11巨噬细胞NO的分泌量明显增加,外周血和脾淋巴细胞分泌NO量升高,但差异不显著(图2-A);ELISA法分析细胞分泌iNOS情况,结果与对照组相比,子孢子组HD11巨噬细胞iNOS的分泌量显著增加、外周血淋巴细胞中iNOS的含量与对照组接近差异不显著、脾淋巴细胞分泌iNOS的含量略低于对照组,但差异不显著(图2-B);提取各组细胞总RNA,采用荧光定量PCR检测iNOS的相对基因表达量,子孢子组iNOS的表达量差异显著高于对照组 (图2-C)。

图2 鸡球虫对鸡免疫细胞分泌NO及mRNA表达的影响 Fig.2 Effects of chicken coccidian on NO secretion from immune cells and its mRNA expression

2.3 鸡柔嫩艾美尔球虫对免疫细胞分泌细胞因子及mRNA表达的影响

ELISA分析细胞分泌细胞因子的情况,结果球虫子孢子组HD11巨噬细胞和外周血淋巴细胞分泌IL-2量明显低于对照组,脾淋巴细胞分泌IL-2的含量较对照组有所增多但差异不显著(图3-A);采用荧光定量PCR检测IL-2基因mRNA表达,子孢子组IL-2相对基因表达量略低于对照组,但差异不明显(图3-B)。子孢子组HD11巨噬细胞和脾淋巴细胞IFN-γ含量明显高于对照组,但外周血淋巴细胞IFN-γ分泌量差异明显低于对照组(图3-C),子孢子组IFN-γ相对基因表达量差异不明显接近对照组(图3-D)。

图3 鸡球虫对免疫细胞分泌细胞因子及mRNA表达的影响 Fig.3 Effects of chicken coccidian on cytokine secretion from immune cells and its mRNA expression

2.4 鸡柔嫩艾美尔球虫对巨噬细胞吞噬及表面分子表达的影响

HD11巨噬细胞培养24 h后采用中性红法检测鸡球虫对巨噬细胞吞噬功能的影响,结果鸡球虫子孢子组HD11巨噬细胞A540 nm处吸光度值极显著高于对照组(图4)。采用流式细胞术检测细胞表面分子KUL01和MHC-Ⅱ表达,结果子孢子组HD11巨噬细胞共同表达KUL01和MHC-Ⅱ(图5)与仅表达KUL01表面分子阳性细胞百分率都显著低于对照组,但仅表达MHC-Ⅱ阳性细胞百分率和平均荧光强度统计差异明显高于对照组(图6)。

图4 鸡球虫对巨噬细胞吞噬作用的影响 Fig.4 Effects of chicken coccidian on the phagocytosis of the macrophages

A.流式图;B.阳性细胞百分率;C.荧光强度 A,B and C mean flow cytometry chart, positive cell percentage andfluorescence intensity respectively 图5 鸡球虫对巨噬细胞表面分子表达的影响 Fig.5 Effects of chicken coccidian on the expression of surface molecules in macrophages

A.KUL01阳性细胞百分率;B.KUL01荧光强度;C.KUL01阳性细胞百分率;D.KUL01荧光强度 A.positive cell percentage of KUL01; B. fluorescence intensity respectively of KUL01; C.positive cell percentage of MHC-II; D. fluorescence intensity respectively of MHC-II 图6 鸡球虫对巨噬细胞表面分子KUL01和MHC-Ⅱ表达的影响 Fig.6 Effects of chicken coccidian on the expression of KUL01 and MHC-II surface molecules in macrophages

3 讨 论

1.2.7 RT-PCR法检测细胞因子mRNA

细胞因子主要是由免疫细胞经抗原刺激后产生的一种多肽或蛋白质,在机体的免疫应答反应中具有重要的调节作用[12]。IL-2是T细胞产生的一种细胞因子,有着十分重要的免疫调节作用。研究发现,在感染性疾病中IL-2主要是促进淋巴细胞、NK细胞等增殖及细胞因子的分泌,并增强其抗原递呈作用[13]。研究认为,IL-2是调节T、B淋巴细胞成熟、增殖以及细胞因子分泌的中心环节,对特异性和非特异性免疫都有重要作用[14]。抗原刺激T细胞产生的IFN-γ,刺激造血细胞增殖分化,加强MHC抗原的表达,尤其针对细菌、寄生虫等病原的非特异性免疫有促进作用[15]。潘虹等研究发现,IFN-γ能够抑制球虫在机体体内的发育,降低卵囊的生殖能力、增加机体体重[16]。TNF是由巨噬细胞分泌的炎性因子,能增强巨噬细胞的吞噬功能,刺激多种免疫细胞产生NO,抑制球虫线粒体功能,影响发育,导致虫体死亡[17]。本试验结果子孢子显著促进HD11巨噬细胞和脾T淋巴细胞分泌IL-2,但对脾T细胞的IFN-γ有一定程度的抑制作用,结果表明鸡柔嫩艾美尔球虫可能调节淋巴细胞部分细胞因子的分泌。崔洋[18]等研究的约氏疟原虫感染对小鼠巨噬细胞吞噬及表面分子表达的影响,结果小鼠在感染第5天时脾巨噬细胞吞噬功能开始增强,第10天吞噬达到高峰,与吞噬能力相关的表面分子CD36、CD64等也在第3~5天开始显著升高,结果表明巨噬细胞是抵抗疟原虫发挥免疫作用的重要效应细胞。本试验结果是鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子刺激的HD11巨噬细胞表达与吞噬能力相关的表面分子MHC-Ⅱ的阳性细胞百分率和平均荧光强度显著高于对照组,结果表明巨噬细胞对艾美尔球虫感染有抵抗作用,其结果与研究报道一致。

[2] Johnson J,Reid W M.Antieoeeidial drugs:Lesion seoring teehniques in battery and floor -penexperiments [J].Ex Parasitol,1970,28:30-36

可知今读开口呼的字,知组二等字读ts组,三等除了效摄深摄开口字相拼时读作ts组,其余的都读作组。庄组二等字除了咸摄开口字相拼时读作组,其余的都读作ts组,庄组三等字除了与深山摄开口三等字相拼时读作ts组,其余的都读作组;章组二等字读作ts组,章组三等字读作分别读ts组和组。今读合口呼的字大多数合流,就所调查的所言,都读作组。同时,知庄章合流读组,合口呼变开口呼,除宕江摄入声字。

(3) 荧光定量PCR检测基因表达。PCR反应体系建立:cDNA 2 μL、上下引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq(2X)10 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、灭菌蒸馏水5.6 μL。PCR反应条件为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,49~57 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,40个循环;采用与荧光定量PCR仪配套Step One Software v2.1分析PCR数据。

参考文献

[1] 李国清.兽医寄生虫学[M].北京:中国农业大学出版社,2015:284-288

综上所述,试验结果鸡柔嫩艾美尔球虫刺激免疫细胞增殖提高,巨噬细胞和淋巴细胞NO和iNOS的分泌量明显增加及iNOS基因表达水平上调,但IL-2分泌量下降其mRNA表达下调,免疫相关分子(MHC-II)表达量增加,结果表明鸡柔嫩艾美尔球虫能不同程度影响免疫细胞增殖及产生免疫相关分子。

[8] 于新茂.柔嫩艾美尔球虫感染早期鸡盲肠NOD样受体及相关免疫细胞因子的表达动态分析[D].南京:南京农业大学,2013

[4] 周作勇,王芝英,胡世君,等.艾美尔球虫子孢子体外刺激鸡异嗜白细胞和巨噬细胞炎性细胞因子表达水平[J].中国兽医学报,2014,34(10):1598-1602

[5] 倪风娥,王承民,秦建华,等.鸡球虫免疫研究进展[J].畜禽业,2001,4(1):30-31

妊娠相关内分泌疾病临床指南中,孕前检查项并不包括甲状腺功能筛查,主要筛查项目为有高危因素的孕妇,例如有个人或者家族甲状腺疾病史,甲状腺疾病亚临床状态、甲状腺抗体阳性、有流产史、早产史等孕妇。但是单纯的筛查高危孕妇无法全部有效筛查出甲状腺功能不全患者。

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[3] Jenkins M C,Dame J B.Idetification of immunodominant sulface of Eimeria acervulina sporozoites and meroziotes[J].Mol Biochem Parasitol,1987,25(2):155-164

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[13] 王世成,王江青.寄生虫免疫中的免疫细胞和细胞因子[J].预防兽医学进展,2001,3(4):19-23

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[15] 潘虹,舒丽,侯杰,等.细胞因子在抗鸡球虫感染中的作用及应用[J].中国畜牧兽医,2011,38(7):176-178

对照组饮食控制45例(100.00%)、运动锻炼42例(93.33%)、规律用药 43例(95.56%)、定时血糖检测42例(93.33%)、足部护理 40 例(88.89%)、定期复诊44 例(97.78%);观察组饮食控制38例(84.44%)、运动锻炼32例(71.11%)、规律用药 28例(62.22%)、定时血糖检测30例(66.67%)、足部护理25例(55.56%)、定期复诊26例(57.78%);观察组患者护理依从性明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

[16] 闫宏斌,贾万忠,田广孚,等.鸡抗球虫免疫机理研究进展[J].中国兽医学报,2010,30(8):1139-1144

改革开放初期,中央就多次强调,要大力发展我国食品工业建设。但食品工业的发展并非一蹴而就,起点低、技术薄弱、缺乏创新、内动力不足等问题成为改革过程中的主要制约因素,食品工业发展依旧缓慢。

选取2008年1月1日至2013年1月1日在苏北医院诊断为前列腺癌并接受腹腔镜下前列腺癌根治术患者的临床资料。纳入标准:(1)患者临床资料完整;(2)前列腺癌病理类型为腺癌。排除标准:(1)放弃治疗者;(2)外伤或意外死亡者。

[17] 于新茂.柔嫩艾美尔球虫感染早期鸡盲肠NOD样受体及相关免疫细胞因子的表达动态分析[D].南京:南京农业大学,2013

[18] 崔洋,刘军,吴忆,等.约氏疟原虫感染小鼠的巨噬细胞表面吞噬相关分子的研究[J].寄生虫与医学昆虫学报,2007,14(2):71-75

李可,徐小艾,李秋明,田美杰,沈红
《北京农学院学报》2018年第2期文献

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