0 引言

微生物的硫氧化对元素硫的生物地球化学循环具有重要的作用。对于嗜酸硫氧化微生物而言，元素硫不仅是其细胞体的重要组成成分，而且还是它们生长代谢的重要能量来源[1]。嗜酸硫氧化微生物对硫具有氧化作用，因而被广泛应用于复杂低品位原生硫化矿生物浸出、金矿表面的氧化预处理、硫化矿尾矿的治理等有价金属回收方面[2-3]。这类浸矿微生物主要是一些嗜酸细菌和古菌，其中以中温细菌的研究和应用最多，然而，中温细菌对黄铜矿类原生硫化矿的浸出效果尚不能令人满意。由于嗜酸热古菌（Acidianus manzaensis）与细菌在细胞结构、适宜生长环境、硫氧化能力、硫氧化代谢系统、基因结构及其功能等方面存在着显著差异，因此它们具有不同的硫氧化机制。研究表明，嗜酸热古菌具有耐高温的特点，能解决大量黄铜矿类原生硫化矿用细菌难以浸出的问题，并能显著改善生物浸出速率和浸出率，是工业应用最具潜力的一类浸矿微生物[4-5]。目前关于极端嗜酸热古菌的氧化过程研究较少，导致人们对极端嗜酸热古菌硫氧化过程与高温生物浸出的关系缺乏清晰的认识和了解[6-9]。

“自12月1日起，上海噪音80分贝以上9座以下客车城市道路禁行；发动机、排气管、消音装置禁止改装；违者罚款、扣分、复原。”

S.Mangold和J.Kucera等[10-11]利用典型嗜酸硫杆菌属Acidithiobacillus.spp对单质硫（S0）进行生物氧化时发现，疏水性的S0必须先经过嗜酸硫氧化细菌的有效吸附和外膜蛋白对其的活化作用，再经膜蛋白的转运进入细胞周质空间后，才能被细菌有效地氧化利用。而作为同样能够氧化S0的嗜酸热古菌而言，它们具有独特的生理生化特性，尤其是它们的细胞结构、基因组的硫代谢与细菌相比存在巨大的差异，其S0的氧化机制与氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）等中温细菌有哪些区别与联系还不清楚。有关研究表明，嗜热古菌氧化S0所需的硫氧化还原酶（sulfur oxygenase reductase，SOR）只存在于细胞质中，胞外的S0首先要经过跨膜转运进入细胞质中，才能被SOR进一步氧化[12]。然而S0的微生物氧化过程十分复杂，在有氧条件下，SOR能以S0为底物催化其发生歧化反应，生成亚硫酸盐、硫代硫酸盐和硫化氢，这些中间产物进而被相应的硫氧化酶氧化，最终生成硫酸盐，并不断伴随有电子传递至相应的末端氧化酶为细胞生长提供能量。另外，S0主要以环状形态且不溶于水的S8形式存在。从SOR蛋白质的晶体结构可知，S0只能以线性硫的形式（即主要是多聚硫化物（polysul fides（Sn2-））的形式）才能被SOR催化反应。因此，胞外疏水性的环状硫S8首先要进行开环，形成线状硫，进而被转运至细胞质中被SOR催化反应[13]。然而，目前对于嗜酸热古菌如何将环状硫S8开环并转运至细胞质中的作用机理鲜有报道。因此，开展嗜酸热古菌硫氧化相关膜蛋白质的筛选和鉴定研究，有助于揭示和阐明嗜酸热古菌氧化硫的分子机制。

综上所述，本文以典型的嗜酸热古菌A.manzaensis为研究对象，采用比较蛋白质组学的方法筛选并鉴定与硫氧化相关的膜蛋白，并利用温度诱导Triton X-114两相分离萃取技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、 双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）、基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱（matrixassisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry/time of flight mass spectrometry，MALDITOF/TOF）、实时荧光定量PCR技术（real timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）等对筛选得到的膜蛋白基因进行转录水平验证，以期找到更多与硫氧化相关的膜蛋白，为阐明嗜酸热古菌硫氧化机制的相关研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 试剂与设备

硫粉、FeSO4•7H2O、聚氧乙烯单叔辛基苯基醚（Triton X-114）、聚丙烯酰胺、苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）、十二烷基磺酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）、考马斯亮蓝R-250、二流苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺、Tris-碱、盐酸（HCl）、壬基酚聚氧乙烯醚（polyoxyethylene nonylphenyl ether ，NP-40）、溴酚蓝、尿素、硫脲、丙酮、磷酸盐缓冲液、过硫酸铵、四甲基乙二胺（N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）、透析袋（截留分子量3～5 kDa），均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产；

胰蛋白酶（trypsin），Sigma-T7409，由美国Sigma公司生产；

细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取试剂盒，均由天根生化科技（北京）有限公司生产；

固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG）干胶条（pH 3～10， 24 cm）、IPG缓冲液（pH 3～10）、Ettan IPGphor 3等电聚焦系统和电泳系统，均由通用电气公司生产；

目前对于古菌中起转运S0的膜蛋白还未有报道。因此本实验基于比较蛋白质组学方法筛选了8个与嗜酸热古菌A.manzaensis氧化S0相关的膜蛋白，再对膜蛋白斑点8号即未知功能膜蛋白的序列进行生物信息学分析后，发现该未知功能的膜蛋白富含—SH且含有—CXXC—功能域，而且RT-qPCR结果显示其在S0的表达量较高（相对表达量为16.92±0.57），由此推测该蛋白可能通过巯基与S0进行结合，形成Pr—SSnH（n≥2）复合物，再对S0进行跨膜转运。转运到细胞质中的S0被嗜酸热古菌的SOR催化同时发生氧化和还原反应，生成S2O32-离子、SO32-离子和H2S，即

iCycler iQTM Real-Time PCR仪，由伯乐生命医学产品公司生产；

Navigation Risk Analysis for Zhejiang Coastal Waters with Bayesian Network

Uniscan Scanner图像透射扫描仪，C10880型，由清华紫光股份有限公司生产；

MALDI-TOF/TOF，5800型，由AB Sciex公司生产。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培养基

菌株A.manzaensis YN-25由中南大学生物冶金重点实验室提供。培养基的配方（单位为质量浓度）为：0.5 g/L 的 MgSO4•7H2O，0.5 g/L 的 K2HPO4，3.0 g/L 的 (NH4)2SO4，0.1 g/L 的 HCl， 0.01 g/L的Ca(NO3)2。将A.manzaensis菌置于装有培养基的500 mL三角瓶中，并添加质量分数为0.02%的酵母提取物作为生长因子，再分别加入质量浓度为10 g/L的S0和质量浓度为20 g/L的FeSO4•7H2O作为能源底物，在65 ℃、170 r/min的空气浴摇床中培养。初始接种菌浓度均为107个/mL。

1.2.2 S0和Fe2+能源底物中生长的A.manzaensis菌的膜蛋白提取

本文用温度诱导的Triton X-114两相分离萃取技术选择性分离A.manzaensis菌的膜蛋白。具体步骤[14]如下：1）先将2种不同能源底物下培养至对数中期的A.manzaensis菌于4 ℃、8 000 r/min下离心10 min进行收集，再用pH值为7.3的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞后，离心再次收集菌体；2）向浓度为2 mmol/L的PBS溶液中添加质量分数为10%的Triton X-114后，将菌体悬浮于PBS溶液中，并添加浓度为1 mmol/L的PMSF溶液，以防止膜蛋白降解，再将细胞悬液置于冰浴下缓慢摇动1 h后，10 000 r/min下离心15 min，收集上清液；3）将收集得到的上清液在37 ℃的水浴锅中静置15 min，诱导溶液分相，再在37 ℃、1 500 r/min下离心10 min，促进相分离得到上层水相和下层Triton X-114相；4）向下层含有膜蛋白的Triton X-114相中加入4倍体积的冷丙酮，置于-20 ℃下过夜，静置沉淀膜蛋白；5）将沉淀得到的膜蛋白重新悬浮于去离子水中，并置于截留分子量为3～5 kDa的透析袋中透析72 h（每12 h换一次去离子水）；6）将透析后的膜蛋白经冷冻干燥后，置于-20 ℃保存备用。

1.2.3 SDS-PAGE分析

将A.manzaensis菌在以S0和Fe2+为能源底物中生长时所提取的膜蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析。采用质量分数为5%的浓缩胶与质量分数为12%的分离胶，用Bradford法测定膜蛋白浓度后，取15 μg膜蛋白与3 μL的上样缓冲液充分混匀并煮沸10 min后上样，待电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色，再用Uniscan Scanner图像透射扫描仪透射扫描，光学分辨率为300 dpi。

1.2.4 2-DE分离膜蛋白

2-DE的第一向等电聚焦采用pH值为3～10、24 cm的固相pH梯度干胶条，上样量为350 mg，聚焦总伏时为80 kV·h。先分别将A.manzaensis菌在以S0和Fe2+为能源底物时提取得到的膜蛋白溶解于裂解液中，用Bradford法测定膜蛋白浓度后，取含有350 mg膜蛋白的裂解液与600 μL水化液（配方为：浓度为7 mol/L的尿素、2 mol/L的硫脲、18 mmol/L的DTT，质量分数为2%的CHAPS、1%的NP-40、0.5%的IPG缓冲液、0.002%的溴酚蓝）充分混匀，采用胶内水化上样方式将膜蛋白加到预制干胶条中上样，聚焦结束后取出胶条，进行IPG胶条平衡2次，第一次在平衡缓冲液（配方为：浓度为6 mol/L的尿素，质量分数为2%的SDS、0.002%的溴酚蓝，浓度为50 mmol/L、pH值为8.8的Tris-HCl，体积分数为30%的甘油）中加入质量分数为1%的DTT，第二次在平衡缓冲液中加入质量分数为2.5%的碘乙酰胺，每次平衡的时间均为15 min。

2-DE的第二向电泳步骤为：首先，用电泳缓冲液润洗平衡后的胶条，以去除多余的平衡缓冲液；其次，转入事先制备好的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶的质量分数为12.5%）上，并用2 mL质量分数为0.5%的低熔点琼脂糖封胶；再次，利用Ettan DALT six垂直电泳系统进行第二向电泳；最后，采用考马斯亮兰R-250对凝胶进行染色，并采集凝胶图像。

本调查的解释变量是风险认知影响因素，被解释变量是风险认知情况。首先运用SPSS22.0通过主成分分析法对风险认知情况进行因子分析，并按照最大方差法进行因子旋转，以特征值大于1为标准提取公因子，并剔除因子载荷小于0.5的题项。再对风险认知的情况因素进行t检验和多元线性阶层回归分析，以P<0.05为差异统计学意义。

1.2.5 A.manzaensis硫氧化相关膜蛋白的质谱分析

本文采用Image Master 2D软件对分离得到的A.manzaensis菌在以S0和Fe2+为能源底物下生长的膜蛋白图谱进行分析。以Fe2+为能源底物的电泳图谱作为对照，筛选以S0为能源底物时差异表达的斑点，选择挖取膜蛋白点，转入离心管，加入200～400 μL脱色液（即添加体积分数为30%乙腈的100 mmol/L NH4HCO3），冷冻干燥后加入5 μL质量浓度为10 mg/L的测序级Trypsin溶液，酶解反应在37℃下进行20 h；在原离心管内加入100 μL的乙腈/三氟乙酸混合液（体积分数为60%的乙腈、0.1%的三氟乙酸），超声15 min，将上述样品冻干，加入2 μL体积分数为20%的乙腈复溶，混匀后取1 μL，点至样品靶上，待其干燥后，再点入0.5 μL过饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液（体积分数为50%的乙腈、0.1%的三氟乙酸）并干燥，样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽，并用MALDI-TOF/TOF进行测试分析。

据调查结果选取具有代表性的不同品质、类型的卫生纸做为实验对象，分别为低档卫生纸(粗制低价)、中档卫生纸(普通一般)、高档卫生纸(昂贵小众)及报纸(图1).

1.2.6 数据库检索鉴定膜蛋白

质谱分析结束后，采用Mascot 2.2软件将膜蛋白的肽指纹图谱在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）和Swiss-Prot数据库进行鉴定，再采用ProtParam工具（http://web.expasy.org/protparam）在线分析膜蛋白的理论等电点与分子量[15]，并用已有文献报道的方法预测膜蛋白的亚细胞定位[16]。

1.2.7 RT-qPCR验证筛选膜蛋白

通过NCBI检索鉴定得到A.manzaensis菌在以S0为能源底物时表达量明显上调的膜蛋白基因，再采用Primer 3（v.0.4.0）（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）在线设计引物，并经湖南擎科生物技术有限公司合成。

然而,蠕虫状链模型也存在一些不足.由于蠕虫状链用投影长度来表示分子链尺寸,看上去没有用到统计单元数的统计关系,统计单元的多寡仅影响其投影的长度,不影响计算结果,因此可用于描述那些因统计单元数不足而无法用等效自由结合链来处理的分子链.但实际上,不断投影取最后的投影长度的方法也是统计的结果.这种暗含式的统计处理方法很隐蔽,使人们在将其运用到刚性链时没有觉得有什么不妥.

将提取的细菌基因组DNA模板进行PCR扩增，再对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析结果如图3所示。由图可知，所有设计的基因引物的PCR扩增产物均为单一明亮的条带，且未生成引物二聚体，这说明所设计的引物特异性较好，片段大小也和设计引物的理论扩增长度相一致；将扩增产物进行测序后，再经BLAST进行序列比对，结果为目的基因，这说明所设计的引物序列可用于后续的RT-qPCR验证实验。

式中：E为扩增效率；ΔΔCq为荧光信号达到域值时的循环次数。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE

但是该反应不能与电子传递进行耦合，这说明该反应不能为细胞生长提供能量。因此，当嗜酸热古菌在以S0作为能源底物生长时，还需要其他的酶对S2O32-离子、SO32-离子和H2S进行氧化并与电子传递进行耦合来产生能量[26]。已有文献报道，在与A.manzaensis菌同一个Acidianus属的不同种A.hospitalis W1中的吡啶核苷酸-二硫键氧化还原酶具有氧化H2S的功能[27]，该酶是硫醌氧化还原酶，其氧化过程与电子传递耦合产生还原性醌（QH2），即

图1 以Fe2+和S0为能源底物下A.manzaensis 菌的膜蛋白SDS-PAGE结果图 Fig.1 SDS-PAGE of A.manzaensis membrane proteins grown on Fe2+ and S0 substrate

2.2 A.manzaensis菌在Fe2+和S0能源底物下膜蛋白的2-DE差异图谱和筛选

A.manzaensis菌在Fe2+和S0能源底物下膜蛋白的2-DE差异图谱如图 2所示。由图可知，总伏时为80 kV•h下，等电聚焦可以得到较为清晰的膜蛋白斑点，但是膜蛋白斑点出现拖尾现象，这是因为膜蛋白具有非常强的疏水性，等电聚焦时，膜蛋白容易在IPG胶条内形成沉淀，导致部分膜蛋白聚焦不完全。该2-DE差异图谱可以进一步用于后续比较蛋白质组学的差异膜蛋白斑点的筛选和质谱鉴定，从而获得与S0氧化相关的膜蛋白信息。

由表3可知，通过比较蛋白质组学方法筛选在S0能源底物中A.manzaensis菌的膜蛋白的基因表达量均显著高于在Fe2+能源底物中的，这说明筛选得到的膜蛋白所对应的基因在转录水平上均显著表达上调。据资料显示，微生物中的铁硫蛋白和赤鲜素蛋白是重要的电子传递体，是微生物呼吸链上的重要组成蛋白。因此，本实验筛选得到的Rieske铁硫蛋白SoxL2和赤鲜素蛋白可以视为嗜酸热古菌呼吸链上的电子传递体，它们对S0氧化过程中的能量产生具有重要的作用[18]。转录激活蛋白（TenA家族）可能对细胞氧化S0相关的膜蛋白的转录起调控作用，乙酰/丙酰辅酶A羧化酶在微生物生长和脂肪合成中发挥着重要的作用，这些酶都可能与嗜酸热古菌A.manzaensis氧化S0密切相关。此外，实验筛选出来的膜蛋白中还有1个属于未知功能蛋白（蛋白斑点序号为10），它与嗜酸热古菌A.manzaensis氧化S0的作用还有待进一步研究。

经过一个周期的研究发现,观察组实习生成绩明显高于对照组实习生,并且观察组患者满意度明显优于对照组。两组实习生对比差异具有统计学意义(p<0.05),具体见表1.

图2 以Fe2+和S0为能源底物下A.manzaensis菌的膜蛋白2-DE差异图谱 Fig.2 Two-dimensional electrophoresis gels of A.manzaensis membrane proteins grown on Fe2+ and S0 substrates

注：图中方框为用于质谱鉴定的膜蛋白斑点，数字为斑点序号。

2.3 与S0氧化相关的膜蛋白质谱鉴定

通过比较蛋白质组学方法筛选的A.manzaensis菌与S0氧化相关的膜蛋白斑点经过胶内酶切，再进行MALDI-TOF/TOF分析和对应膜蛋白的肽指纹图谱鉴定，结果如表1所示。由表可知：挖取的10个膜蛋白斑点只鉴定了8个（吡啶核苷酸-二硫键氧化还原酶、Rieske铁硫蛋白SoxL2、TenA家族的转录激活因子、赤鲜素蛋白以及2个假定蛋白），其原因是4号和5号膜蛋白斑点为过氧化物酶，6号和7号膜蛋白斑点为乙/丙酰辅酶A羧化酶，这表明上述2种膜蛋白有不同的构象异构体存在，构象异构体的差异导致了等电点的轻微不同，即斑点等电点位置发生漂移；对鉴定的膜蛋白进行亚细胞定位预测发现，通过筛选得到的与S0氧化相关的膜蛋白大部分位于细胞膜，其中2个假定蛋白和转录激活蛋白（TenA家族）预测为未知的亚细胞定位，这说明筛选鉴定得到的膜蛋白与采用温度诱导的Triton X-114两相分离萃取技术提取的膜蛋白基本吻合；对鉴定的膜蛋白序列进行分析可知，8号斑点所对应的未知功能的膜蛋白富含巯基（—SH）且含有一个及以上的—CXXC—功能域。

表1 S0能源底物下差异蛋白斑点的MALDI-TOF/TOF鉴定结果 Table 1 Identification of proteins spots of A.manzaensis grown on S0 substrate by MALDI-TOF/TOF

注：“*”表示富含巯基和含有一个及以上—CXXC—功能域。

?

2.4 RT-qPCR对S0氧化相关膜蛋白的验证

[13]URICH T，GOMES C M，KLETZIN A，et al.X-Ray Structure of a Self-Compartmentalizing Sulfur Cycle Metalloenzyme[J].Science，2006，311(5763)：996-1000.

表2 RT-qPCR引物序列信息 Table 2 Primers used in RT-qPCR

?

用于RT-qPCR的细胞收集于对数中期，先用细菌总RNA提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取总RNA和基因组DNA，以总RNA为模板，采用ReverTra Ace-α-第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，合成相应的cDNA；再以cDNA为模板，使用SYBR Green高效率荧光定量PCR Mix QPK-201配置反应体系，利用iCycler iQTM Real-Time PCR仪进行分析，每个反应设3个重复。对RT-qPCR采集的数据，用16S rDNA作为内参基因进行校正，采用相对定量法分析各个基因在不同能源底物培养时的相对表达量[17]，即

图3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析图 Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of the PCR products based on the primes

注：数字为膜蛋白的序号，M为DNA Marker。

实验采用RT-qPCR技术对筛选得到的膜蛋白进行转录水平验证，验证结果用式（1）表示，并采用t检验进行差异性分析，分析结果如表3所示。

当土壤介电常数为ε，天线间距为L，地面直达波的传播时间t可以通过对雷达记录剖面的分析来提取，传播速度v=L/t，则有：

表3 基于比较蛋白质组学方法筛选的膜蛋白基因RT-qPCR结果 Table 3 RT-qPCR results of the identified membrane protein genesbased on comparative proteomics

注：p为显著性。

序号p 1 2 3 4～5 6～7 8 9 1 0膜蛋白功能注释吡啶核苷酸-二硫键氧化还原酶Rieske铁硫蛋白SoxL2转录激活蛋白（TenA家族）过氧化物酶乙/丙酰辅酶A羧化酶假定蛋白赤鲜素蛋白假定蛋白相对表达量39.83±1.05 20.69±0.40 05.48±0.74 02.88±0.15 17.16±1.98 16.92±0.57 13.93±0.98 01.20±0.53≤0.05≤0.05≤0.05≤0.05≤0.05≤0.05≤0.05≤0.05

利用Image Master 2D软件对2-DE图谱进行分析可知：A.manzaensis菌在2种不同的能源底物下生长的膜蛋白的2-DE图谱存在显著的差异；与相应的SDS-PAGE结果（见图1）相比，2-DE可以分离得到更多的膜蛋白，如在S0为能源底物下，在相对分子质量较小且酸性端（pH值为3）附近，膜蛋白斑点展现较多，但在Fe2+为能源底物下却没有出现膜蛋白斑点，这说明这部分膜蛋白与A.manzaensis菌对S0的氧化利用密切相关。通过比较分析在2种不同能源底物下膜蛋白的2-DE差异图谱后，选择性挖取10个只有在S0能源底物中表达和表达显著上调的膜蛋白斑点进行胶内水解与MALDI-TOF/TOF质谱鉴定。

3 讨论

众所周知，自然环境下S0主要以环状形态且不溶于水的S8形式存在，细胞对疏水性S0的氧化过程十分复杂[19-20]。对于古菌而言，S0的初始氧化酶SOR只存在于细胞质中，因此胞外S0的氧化需要经跨膜转运进入细胞质中才能进行。当A.manzaensis菌在S0中生长时，会在细胞表面形成大量胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS），EPS可以介导细胞对疏水性S0的吸附过程，而被细胞吸附后的S0还需经外膜富含巯基（—SH）蛋白的转运，才能被进一步氧化[21-23]。T.Rohwerder等[24]研究发现，S0可能会在外膜富含巯基和S8的作用下，形成类似的Pr—SSnH（n≥2）结构化合物，即

该化合物会被外膜蛋白转运至细胞周质空间中进行氧化。P.RamíRez等[25]研究发现，将在Fe2+为能源底物下生长的A.ferrooxidans细胞转移至S0中培养时，细胞会有一个分子量为44 kDa的膜蛋白明显表达上调，且该蛋白属于外膜蛋白。

ReverTra Ace-α-第一链cDNA合成试剂盒、SYRB Green荧光定量qPCR Mix（QPK-201型），均由日本东洋纺株式会生产；

采用温度诱导的Triton X-114两相分离萃取技术对A.manzaensis菌在2种不同能源底物Fe2+和S0下生长所提取的膜蛋白进行选择性分离后，再利用SDS-PAGE进行初步分析，结果如图1所示。图中M为预染蛋白Marker。由图可知：两相分离萃取技术能够有效提取A.manzaensis菌的膜蛋白，而且不同能源底物下培养的A.manzaensis菌的膜蛋白表达种类有很大的差异，这说明能源底物的差异诱导A.manzaensis菌能够成功地合成不同的膜蛋白，换而言之，不同的膜蛋白条带与对应的能源底物密切相关。当以Fe2+为能源底物时，A.manzaensis菌的膜蛋白条带主要集中于55 kDa以上的部分；而以S0为能源底物时，A.manzaensis菌的膜蛋白条带主要集中于43 kDa以下的部分。从图1中还可发现，在2种不同能源底物下，A.manzaensis菌也有相同的膜蛋白条带，其可能为A.manzaensis 菌的结构蛋白。考虑到SDS-PAGE的分辨率有限，对相对分子量差异较小的膜蛋白无法进行有效地分离，本文随后采用了分辨率更高的2-DE对相关膜蛋白作进一步分析。

还原性醌被氧化产生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）[28]。因此，本实验通过比较蛋白质组学筛选得到了吡啶核苷酸-二硫键氧化还原酶，其RT-qPCR结果显示该酶在以S0为能源底物时的表达量较高（相对表达量为39.83±1.05），这说明该酶在A.manzaensis菌中具有氧化H2S的作用。

4 结语

本文通过比较蛋白质组学方法对嗜酸热古菌A.manzaensis中硫氧化相关的膜蛋白基因进行了筛选和鉴定，发现了8个与硫氧化相关的膜蛋白，并从转录水平对其进行了验证。实验结果表明，一个未知功能的膜蛋白富含巯基及—CXXC—功能域，该膜蛋白可能通过巯基（—SH）对S0进行键和并生成Pr—SSnH（n≥2）化合物，该化合物能协助单质硫跨膜转运；实验还筛选得到了硫醌氧化还原酶、电子传递蛋白、转录激活蛋白和与细胞生长相关的蛋白，这些膜蛋白在嗜热古菌A.manzaensis氧化S0的过程中起非常重要的作用。

参考文献：

[1]ROHWERDER T，SAND W.Oxidation of Inorganic Sulfur Compounds in Acidophilic Prokaryotes[J].Engineering in Life Sciences，2007，7(4)：301-309.

以芋螺基因组DNA样品为模板，采用经优化的ITS-PCR反应体系进行扩增，分别取5 μL扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。将扩增具有清晰、明亮、片段大小符合预期的条带样品送深圳华大基因进行测序分析。

[2]ROHWERDER T，GEHRKE T，KINZLER K，et al.Bioleaching Review Part A：Progress in Bioleaching：Fundamentals and Mechanisms of Bacterial Metal Sulfide Oxidation [J].Applied Microbiology & Biotechnology，2003，63(3)：239-248.

[3]VERA M，SCHIPPERS A，SAND W.Progress in Bioleaching：Fundamentals and Mechanisms of Bacterial Metal Sulfide Oxidation：Part A[J].Applied Microbiology & Biotechnology，2013，97(17)：7529-7541.

[4]朱 薇.嗜热古菌浸出黄铜矿的硫氧化活性与群落结构及硫形态关联性研究[D].长沙：中南大学，2012.ZHU Wei.Research on the Correlations Among Sulfur Oxidation Activity,Community Structure and Sulfur Speciation in Bioleaching Chalcopyrite with Thermophilic Archaea[D].Changsha：Central South University，2012.

[5]ZHU Wei，XIA Jinlan，PENG Anan，et al.Characterization of Apparent Sulfur Oxidation Activity of Thermophilic Archaea in Bioleaching of Chalcopyrite [J].Transactions of Nonferrous Metals Society of China，2013(8)：2383-2388.

[6]彭安安.嗜酸硫氧化细菌元素硫活化氧化机制研究[D].长沙：中南大学，2012.PENG Anan.Study on the Sulfur Activity and Oxidation Mechanism of Acidophilic Sulfur-Oxidizing Bacteria[D].Changsha：Central South University，2012.

[7]LITTLE B J，POPE R K，RAY R I.Relationship Between Corrosion and the Biological Sulfur Cycle：A Review[J].Corrosion，2000，56(4)：433-443.

[8]KLETZIN A，URICH T，MÜLLER F，et al.Dissimilatory Oxidation and Reduction of Elemental Sulfur in Thermophilic Archaea[J].Journal of Bioenergetics，2004，36(1)：77-91.

[9]FASHOLA M O，NGOLEJEME V M，BABALOLA O O.Diversity of Acidophilic Bacteria and Archaea and Their Roles in Bioremediation of Acid Mine Drainage[J].British Microbiology Research Journal，2015，8(3)：443-456.

[10]MANGOLD S，VALDÉS J，HOLMES D S，et al.Sulfur Metabolism in the Extreme Acidophile Acidithiobacillus Caldus[J].Frontiers in Microbiology，2011，2(1)：1-18.

子宫颈癌在妇科肿瘤中发病率较高，而且在近年来呈现发病率升高、病患呈年轻化趋势。广泛性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术仍是治疗早期子宫颈癌的标准手术模式，但由于术中需要切除次3～4 cm阴道壁组织使阴道缩短；加之手术对盆腔内脏神经的损伤，极易导致患者术后出现膀胱功能受损，出现尿频、尿急、排尿困难等表现[6-7]；阴道功能也发生相应变化，约30%以上患者可出现阴道干涩、性交痛等性功能障碍表现[8-9]，严重影响患者生活质量。因此，如何在能够达到治疗子宫颈癌的目的，同时能够改善患者术后膀胱功能、术后性生活质量成为妇科研究的热点。

[11]KUCERA J，SEDO O，POTESIL D，et al.Comparative Proteomic Analysis of Sulfur-Oxidizing Acidithiobacillus Ferrooxidans CCM 4253 Cultures Having Lost the Ability to Couple Anaerobic Elemental Sulfur Oxidation with Ferric Iron Reduction[J].Research in Microbiology，2016，167(7)：587-594.

[12]ZHANG Ruiyong，NEU T R，ZHANG Yutong，et al.Visualization and Analysis of EPS Glycoconjugates of the Thermoacidophilic Archaeon Sulfolobus Metallicus[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99(17)：7343-7356.

在NCBI数据库中，检索上文得到的与S0氧化相关的膜蛋白，查找其基因序列，再根据基因序列设计相应的引物，引物相关信息如表2所示。

[14]夏金兰，欧阳叙东，张成桂，等.大肠杆菌外膜蛋白的分离及其双向电泳图谱的建立[J].现代生物医学进展，2009，9(2)：201-204.XIA Jinlan，OUYANG Xudong，ZHANG Chenggui，et al.Rapid and Efficient Extraction of Outer Membrane Proteins from Escherichia Coli and Establishment of the Two-Dimensional Electrophoresis Maps[J].Process in Modern Biomedicine，2009，9(2)：201-204.

散会后，大家一起到二楼的餐厅聚餐。席间，齐眉给每人分发了一个红包。高潮拿到红包后，心里直痒痒，瞅个机会跑到卫生间，偷偷地打开红包，一看，壹仟圆，心里美滋滋的。高潮不想喝太多的酒，就赖在小隔间，坐在马桶盖上把玩手机耗时间，反正这里也很干净，一丝儿异味都闻不到。不大会儿，就听到外面两个小便的人在交谈。一个说，乖乖，好大方，红包就装了贰仟圆。另一个嚷嚷道，这狗日的梅董也太狗眼瞧人低了吧，只给了老子陆佰块。高潮听第一人说的时候，心中就诅咒了梅宏图几句，待第二个人的话一出口，高潮登时心平气和了。

[15]ALMÁRCEGUI R J，NAVARRO C A，PARADELA A，et al.Response to Copper of Acidithiobacillus Ferrooxidans ATCC 23270 Grown in Elemental Sulfur[J].Research in Microbiology，2014，165(9)：761-772.

[16]YU N Y，WAGNER J R，LAIRD M R，et al.PSORTb 3.0：Improved Protein Subcellular Localization Prediction with Refined Localization Subcategories and Predictive Capabilities for All Prokaryotes[J].Bioinformatics，2010，26(13)：1608-1615.

[17]KUCERA J，ŠEDO O，POTESIL D，et al.Comparative Proteomic Analysis of Sulfur-Oxidizing Acidithiobacillus Ferrooxidans CCM 4253 Cultures Having Lost the Ability to Couple Anaerobic Elemental Sulfur Oxidation with Ferric Iron Reduction[J].Research in Microbiology，2016，167(7)：587-594.

[18]AUERNIK K S，KELLY R M.Identification of Components of Electron Transport Chains in the Extremely Thermoacidophilic Crenarchaeon Metallosphaera Sedula Through Iron and Sulfur Compound Oxidation Transcriptomes[J].Applied &Environmental Microbiology，2008，74(24)：7723-7732.

[19]马亚龙，刘红昌，夏金兰，等.极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis胞外硫活化蛋白质基因的筛选及鉴定[J].生物技术通报，2016，32(12)：143-151.MA Yalong，LIU Hongchang，XIA Jinlan，et al.Screening and Identification of Extracellular Protein Genes Relevant to Sulfur Activation of Extremely Thermoacidophilic Archaea Acidianus manzaensis[J].Biotechnology Bulletin，2016，32(12)：143-151.

[20]杨 云，刘红昌，夏金兰，等.极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及应用[J].生物技术通报，2016，32(11)：130-136.YANG Yun，LIU Hongchang，XIA Jinlan，et al.Establishment of Extraction Methods of Membrane Proteins from Extremely Thermoacidophilic Acidianus manzaensis and Its Preliminary Application[J].Biotechnology Bulletin，2016，32(11)：130-136.

[21]SAND W，GEHRKE T.Extracellular Polymeric Substances Mediate Bioleaching/Biocorrosion Via Interfacial Processes Involving Iron(III) Ions and Acidophilic Bacteria[J].Research in Microbiology，2006，157(1)：49-56.

[22]PENG Anan，XIA Jinlan，LIU Hongchang，et al.Thiol-Rich Proteins Play Important Role in Adhesion and Sulfur Oxidation Process of Acidithiobacillus Ferroxidans[J].Advanced Materials Research，2013，825(23)：137-140.

（91）羽状羽苔 Plagiochila dendroides（Nees.）Lindenb.熊源新等（2006）；杨志平（2006）

[23]LIU Hongchang，XIA Jinlan，NIE Zhenyuan，et al.Differential Expression of Extracellular Thiol Groups of Moderately Thermophilic Sulfobacillus Thermosulfidooxidans and Extremely Thermophilic Acidianus Manzaensis Grown on S0 and Fe2+[J].Archives of Microbiology，2015，197(6)：823-831.

[24]ROHWERDER T，SAND W.Properties of Thiols Required for Sulfur Dioxygenase Activity at Acidic pH[J].Journal of Sulfur Chemistry，2011，29(3/4)：293-302

[25]RAMÍREZ P，GUILIANI N，VALENZUELA L，et al.Differential Protein Expression During Growth of Acidithiobacillus Ferrooxidans on Ferrous Iron，Sulfur Compounds，or Metal Sulfides[J].Applied &Environmental Microbiology，2004，70(8)：4491-4498.

大学生体质弱势群体公共体育教育“互联网+翻转课堂”模式的出现应时顺势，将一改传统公共体育教育教学的沉闷，增强体质弱势大学生体育参与的主观能动性、体育学习的主观感受度与体育习得效率，为大学生体质弱势群体公共体育教育的新时代发展不断注入动力。

[26]KLETZIN A.Oxidation of Sulfur and Inorganic Sulfur Compounds in Acidianus ambivalens[M]//[Anon].Microbial Sulfur Metabolism.Berlin：Springer，2008：184-201.

[27]YOU Xiaoyu，LIU Chao，WANG Shengyue，et al.Genomic Analysis of Acidianus Hospitalis W1 a Host for Studying Crenarchaeal Virus and Plasmid Life Cycles[J].Extremophiles，2011，15(4)：487-497.

在接受调查的5所本科民办高校中，大部分办学时间都不长，双创教育尚处于起步阶段，现状情况如下：第一，双创教育理论体系和实践培训体系不够完善，主要体现在各高校的人才培养方案、配套服务和保障体系方面；第二，针对双创课程设置，没有相对完善的教学计划、模式、师资队伍、相关资源配置等与之匹配。

[28]WAKAI S，KIKUMOTo M，KANAO T，et al.Involvement of Sulfide：Quinone Oxidoreductase in Sulfur Oxidation of an Acidophilic Iron-Oxidizing Bacterium，Acidithiobacillus Ferrooxidans NASF-1[J].Bioscience,Biotechnology,& Biochemistry，2014，68(12)：2519-2528.