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乙酰唑胺对食管癌细胞系E9706的放射增敏作用*

更新时间:2016-07-05

碳酸酐酶(Carbonic anhydrases,CA)可逆性催化二氧化碳到碳酸氢根和氢离子的化学反应,其在维持微环境酸碱平衡中发挥重要作用,CA有16种同工酶,CAIX为膜结合型CA[1]。研究证实CA IX与鼻咽癌、结肠癌放射敏感性有关[2-3]。然而CAIX在食管癌中的放射增敏作用尚不明确。该研究通过观察碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺(Acetazolammide, AZ)对食管癌细胞系EC9706的放射增敏作用,旨在为碳酸酐酶抑制剂作为放射增敏剂应用于临床提供理论依据。

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1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 食管癌细胞系EC9706购于山东省医学科学院细胞室。AZ购自Sigma公司,溶于二甲基4(DMSO)中,配制成1×10-3 mol/L浓度储存液,-20℃保存,使用时培养液稀释至所需浓度,DMSO终浓度<0.3%。DMSO培养基为Gibico公司产品;胎牛血清为杭州四季青产品;鼠抗人Bax单克隆抗体为Lab vision公司产品;鼠抗人Bcl-2单克隆抗体为Sigma公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 EC9706细胞培养于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中,放置于37℃、5%CO2的恒温培养箱内。取指数生长期细胞进行相关实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐(MTT)实验检测AZ对E9706细胞抑制性 每孔5 000个细胞/孔铺96孔板,每孔180 μL体系,培养24 h,细胞贴壁后更换含AZ新鲜培养液。AZ各组浓度为1、5、10 μM。于加药后24、48、72 h进行细胞活性检测,设置无细胞空白对照。每个浓度分别设3个平行孔。各组作用时间结束后,每孔加入5 mg/mL浓度MTT 20μL,继续培养4 h。检测490 nm吸光度值(A),细胞存活率(%)=实验孔A值/对照空A值×100%。

1.2.3 克隆形成实验检测AZ对E9706的放射敏增敏作用 设空白对照组、单纯药物组、单纯照射组、联合组(药物+照射;MTT实验示1 μM AZ作用24 h,EC9706增值抑制率仅为4%),两组中分别设不同剂量照射亚组。0.25%胰酶消化指数生长期EC9706细胞,按50 000细胞接种于100 mm培养皿,置于培养箱培养24 h,联合组更换培养液(含浓度为1 μM AZ),继续培养24 h。对照组及药物组按100细胞/皿接种于60 mm培养皿,无药物培养液继续培养10 d。单纯照射组及联合组分别给以0、2、4、6、8 Gy X-ray照射(直线加速器为Varian 23EX,6MV X-ray,剂量率3 Gy/min,SSD 100 cm,加2 cm等效组织)。照射后,0.25%胰酶消化细胞,台盼蓝(Trypan blue)检测细胞活性,并计数活细胞,根据不同照射剂量(由低到高),分别接种100、500、500、2000、2000个细胞于60 mm培养皿。更换培养液培养10 d,甲醇/乙酸(3∶1)固定细胞,结晶紫染色,计数大于50个细胞的克隆数。每组的每一剂量梯度皆重复3次。克隆形成率(PE)=(克隆数/接种细胞数)×100%,单靶多击模型拟合细胞存活曲线,计算D0值及Dq值。根据单纯乙酰唑胺处理组矫正细胞毒性作用。

1.2.4 流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响 设对照组、单纯药物组、单纯照射组及联合组。指数生长期EC9706细胞经0.25%胰酶消化后,以1×106 细胞/瓶接种于75 mL培养瓶,培养24 h,细胞贴壁后,各组根据需要更换含/不含AZ培养液继续培养24 h。照射组及联合组行6 Gy-X线照射,继续培养24 h。上机进行检测。

1.2.5 Western blot实验检测AZ对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 设对照组和药物组(0.5、1.0、2 μM)。将指数生长期EC9706细胞,按5×106细胞接种于6孔板,置于培养箱培养24 h,药物组更换含不同浓度AZ培养液,继续培养24 h。收集细胞,裂解液在4℃下溶解细胞1 h,12 000r/min离心10 min,收集上清液。严格按考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,用裂解液将各管蛋白浓度调至一致。取等量蛋白SDS-PAGE电泳,电转印法将蛋白转印到硝酸纤维膜上,加Bax、Bcl-2单抗,4℃孵育过夜,电化学发光法显色。

1.3 统计学方法 应用SPASS 14.0软件,计量资料数据表示为组间差异采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验检测AZ对E9706细胞抑制性 AZ对E9706细胞有明显抑制作用,且呈时间浓度依赖性,10.0 μM 72 h抑制率达到62%,而1.0 μM 24 h抑制率仅为4%,故选取1.0 μM作为AZ放射增敏浓度。

表1 AZ对E9706细胞抑制作用

浓度/μM作用时间24h48h72h1.00.960.870.715.00.850.740.5910.00.690.520.38

2.2 克隆形成实验检测AZ对E9706的放射敏增敏作用 AZ(1 μM)处理后,E9706细胞放射敏感性增加(如图1)。Dq、D0值在单纯照射组(RT)分别为2.14、1.93 Gy,联合组分别为1.57、1.38 Gy。放射增敏比1.40。

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图1 乙酰唑胺(AZ)对食管癌细胞E9706细胞放射敏感性的影响

2.3 流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响 如表2示,1μM AZ及X线照射皆可诱导E9706细胞凋亡增加,二者联合后诱导凋亡作用进一步加强,凋亡率可达(19.63±4.0)%。AZ处理后细胞S期细胞减少,提示细胞增殖受到抑制。AZ药物处理后G2/M期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)。

表2 不同处理组E9706细胞凋亡率及细胞周期改变

凋亡率G0/G1SG2/M对照组0.18±0.0941.31±2.5223.07±2.1735.62±3.85单纯药物组3.67±1.340.52±4.0119.08±3.640.40±4.12单纯照射组11.75±2.843.13±4.2419.40±2.8237.47±2.94联合组19.63±4.038.63±3.8916.23±2.4345.14±3.66

2.4 Western blot实验检测AZ对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 不同浓度AZ处理E9706细胞24 h后,影响Bax和Bcl-2蛋白表达。E9706细胞Bax蛋白表达水平与AZ浓度成正比,而Bcl-2蛋白表达与AZ浓度成反比。

图2 AZ对E9706细胞Bax、Bcl-2细胞表达影响

3 讨论

由于肿瘤自身高代谢性及肿瘤血管结构、功能上的不完善,导致肿瘤内具有乏氧、高乳酸浓度、酸中毒等不利肿瘤细胞生长的特点[6]。肿瘤这种微环境特点不仅导致肿瘤侵袭性及转移性增加、预后较差[7],而且导致肿瘤对放化疗抗拒[8]。酸中毒是肿瘤微环境的重要特点之一。CA IX高表达则是肿瘤细胞对抗酸中毒的一种重要代偿机制,CAIX具有降低肿瘤细胞外H+浓度,降低细胞膜内外H+浓度梯度,利于肿瘤细胞将细胞内产生的过多H+通过Na+/H+交换等机制转移到细胞外,保持细胞内中性、偏碱性环境,利于肿瘤细胞生存[8]

食管癌是我国发病率、死亡率“双高”恶性肿瘤,严重威胁人民健康[4]。就诊时因分期晚、不能耐受及患者意愿等原因,大约仅有40%左右患者能进行根治性手术,放射治疗是不可手术食管癌的标准治疗手段,但其3年控制率仅为48%[5]。通过应用放射增敏剂提高肿瘤放射敏感性,是进一步改善食管癌放疗疗效的重要途径。

本研究中,我们发现AZ对食管癌细胞系E9706有细胞生长抑制作用,且与浓度、作用时间呈正相关。AZ在低细胞毒性浓度下具有放射增敏作用。通过细胞周期分析进一步发现AZ具有抑制E9706细胞DNA合成、诱导凋亡和导致G2/M期阻滞作用。Cianchi等[9]发现碳酸酐酶抑制剂抑制碳酸酐酶表达阳性HeLa和786-O细胞增殖、并诱导其凋亡,而对于碳酸酐酶表达阴性786-O/VHL细胞则无以上作用,并发现碳酸酐酶抑制剂降低碳酸酐酶阳性细胞内pH值及增加细胞内神经酰胺浓度。 Dubois等[10]应用HT-29细胞建立结肠癌体内研究模型,发现CAIX抑制剂AZ增加射线照射的肿瘤杀伤作用。近期相关研究发现碳酸酐酶抑制剂对乳腺癌细胞具有诱导凋亡的作用,发挥放射增敏机制与诱导凋亡相关[11-12]。该研究发现AZ对食管癌细胞有相似的作用,抑制细胞增殖、诱导凋亡及放射增敏。进一步研究发现AZ的放射增敏作用与调节凋亡相关蛋白表达及增加放射敏感期G2/M期细胞比例有关。

CA IX在肿瘤发生、发展及治疗疗效方面发挥重要作用。AZ对食管癌细胞具有抑制作用。同时AZ在食管癌细胞系中具有较强的放射增敏作用。CA IX是潜在肿瘤治疗靶点,CA IX 抑制剂也是潜在的放射增敏剂。

参 考 文 献

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[2] Jiang L,Xu G,Li Z,et al.RNAi-mediated knockdown of CAIX enhances the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell line,CNE-2[J].Onco Targets Ther,2017,10(12):4701-4709.

[3] Doyen J,Parks S K,Marcié S,et al.Knock-down of hypoxia-induced carbonic anhydrases IX and XII radiosensitizes tumor cells by increasing intracellular acidosis[J].Front Oncol,2013,2(2):199.

[4] Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

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[10] Dubois L,Peeters S,Lieuwes N G,et al.Specific inhibition of carbonic anhydrase IX activity enhances the in vivo therapeutic effect of tumor irradiation[J].Radiother Oncol,2011,99(3):424-431.

[11] Mohammadpour R,Safarian S,Ejeian F,et al.Acetazolamide triggers death inducing autophagy in T-47D breast cancer cells[J].Cell Biol Int,2014,38(2):228-238.

[12] Bache M,Münch C,Güttler A,et al.Betulinyl Sulfamates as Anticancer Agents and Radiosensitizers in Human Breast Cancer Cells[J].Int J Mol Sci,2015,16(11):26249-26262.

3.3 有关部门缺乏足够的重视 保护区作为生物资源最丰富的区域,划定保护区目的就是要最大程度地保护生物资源,但是由于有部门对保护区的重要性认识不足,对保护区缺乏足够的重视,导致在保护区内的各种开发活动不断发生,对生物资源造成了较大的破坏。

万金良,邢绍芝,王峰,张维明,杨志敏,王振波
《滨州医学院学报》2018年第2期文献

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