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红三叶AFLP体系的建立及优化

更新时间:2016-07-05

扩增片段长度多态性(AFLP)是由RFLP与RAPD结合而成的一种新的分子标记技术,具有RFLP标记和RAPD标记的优点,有“最有力的分子标记”或“下一代分子标记”的称号[7]。因其高多态性,可靠,高效[8],DNA用量少,检测率高[9],重复性高,加上选择为中性[10]等许多优点,AFLP技术普遍应用于生物研究领域。近年来,AFLP技术在牧草种质鉴定方面的应用发展迅速,在紫花苜蓿(Medicago sativa)[11],燕麦(Avena sativa)[12],狗牙根(Cynodon dactylon)[13],老芒麦(Elymus sibiricus)[14-15],扁蓿豆(Medicago sativa)[16],鸭茅(Dactylis glomerata)[17]等牧草的鉴定中均有报道。孟丽娟[18]通过对来自美国、加拿大和俄罗斯的31份红三叶材料运用ISSR分子标记建立并优化了适宜红三叶ISSR分析的最佳反应体系,扩增出58条多态性条带,后通过UPGMA聚类分析将试验材料分为5类。Mamta Gupta等[19]使用36对简单序列重复(SSR)引物分析全球收集红三叶材料的遗传多样性,其扩增片段1~6个,多态性值0.301~0.719,贝叶斯聚类模型分析将研究材料分为3类。Herrmann等[20]利用优化AFLP体系探索了野生和栽培红三叶群体的遗传特性和亲缘关系。Muntean等[21]用AFLP分子标记对红三叶品种遗传多样性进行了评价。虽然AFLP技术的原理简便,但步骤繁多,从酶切反应到银染成像的优化,若一个步骤或条件不合适,就出现带型不稳定、条带不清晰和多态性偏低等问题。所以,以岷山红三叶和红三叶新品系为试验材料,筛选AFLP优化条件,旨在建立适宜红三叶的AFLP反应体系,为红三叶分子遗传研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

田间试验在甘肃省临洮县临洮农校农场进行,地理位置E 103°87′,N 35°37′,海拔1 892 m,降水量562 mm,无霜期80~190 d,年平均气温7.0℃(最高气温34.6℃,最低气温-29.5℃)。土壤为黑麻土,肥力均匀,有灌溉条件,前茬作物为玉米。

1.2 试验材料

试验材料为以岷山红三叶为父本(Male parent,M)、抗白粉病红三叶新品系(甘农PR1)为母本(Female parent,F)杂交形成的F1代群体,以及2亲本。2015年3月下旬将杂交F1代种子点播,株距20 cm,行距30 cm,播种深度1(2 cm,得到F1代群体。于生长期间采摘幼嫩叶片1~2 g,放入液氮保存,带回实验室-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3 试验试剂与仪器

MseI,EcoRI和T4 DNA连接酶购自Thermo Scientific,2×PCR Master Mix与DNA Marker购于BBI Life Sciences。引物及接头(表1)上海生工生物工程有限公司人工合成,其他试剂均为国产分析纯。

试验所用仪器见表2。

2.4.2 2×PCR Master Mix用量筛选 2×PCR Master Mix是即用型的常规PCR预混合溶液,含有Taq DNA Polymerase,dNTP混合物,MgCl2以及优化的缓冲体系,只需加入引物和模板即可进行扩增(图8),其用量大小会直接影响PCR结果。琼脂糖凝胶电泳表明,10 μL PCR产物电泳条带最亮,7 μL PCR产物次之,6 μL PCR产物最暗。

表1 接头和引物序列 Table 1 Sequence of the adapter and primer

接头或引物序列接头或引物序列EcoRI5′⁃CTCGTAGACTGCGTACC⁃3′MseI5′⁃CTCGTAGACTGCGTACC⁃3′双链接头5′⁃CTGACGCATGGTTAA⁃3′双链接头3′⁃CTGACGCATGGTTAA⁃3′E0GACTGCGTACCAATTCM0GATGAGTCCTGAGTAAE1GACGCATGGTTAATTCACCM1GACGATGAGTCCTGAGTAACAAE2GACGCATGGTTAATTCAACM2GACGATGAGTCCTGAGTAACACE3GACGCATGGTTAATTCAAGM3GACGATGAGTCCTGAGTAACAGE4GACGCATGGTTAATTCAGGM4GACGATGAGTCCTGAGTAACTTE5GACGCATGGTTAATTCACAM5GACGATGAGTCCTGAGTAACATE6GACGCATGGTTAATTCACGM6GACGATGAGTCCTGAGTAACTAE7GACGCATGGTTAATTCACTM7GACGATGAGTCCTGAGTAACTCE8GACGCATGGTTAATTCAGCM8GACGATGAGTCCTGAGTAACTG

表2 试验仪器 Table 2 Experimental instrument

仪器名称型号来源高压电泳仪JY⁃ECP3000北京君意东方电泳设备有限公司水平电泳槽JY⁃SPFT北京君意东方电泳设备有限公司台式高速冷冻离心机TGL16M湖南凯达科学仪器有限公司Bio⁃radMyCycler普通PCR仪MyCycler伯乐生命医学产品(上海)有限公司紫外凝胶成像系统UVPGDS⁃8000伯乐生命医学产品(上海)有限公司超微量紫外分光光度计Quawell⁃Q5000伯乐生命医学产品(上海)有限公司电热恒温水浴锅HH⁃W21⁃S上海恒跃医疗器械有限公司相机600D佳能(中国)有限公司

1.4 基因组DNA制备及检测

采用改进CTAB法[22-23]提取红三叶基因组DNA。1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,TE稀释后用超微量紫外分光光度计检测D260nm/D280nmD260nm/D230nm,以确定DNA的纯度与浓度。

2.2.3 EcoRI浓度筛选 电泳结果(图4)表明,1~4条带亮度随内切酶EcoRI浓度增加变大,而5、6条带亮度暗于4。EcoRI浓度筛选结果为8 U。

1.5 体系优化筛选条件

AFLP被认为是十分理想、高效的分子标记技术,己经被广泛应用到水稻等作物的遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位和连锁图谱构建等方面[24]。AFLP试验分析中,DNA模板限制性内切酶酶切是否充分、酶切片段T4DNA连接酶的连接是否成功是影响AFLP试验成功与否的关键,限制性内切酶及 T4DNA连接酶的用量根据模板 DNA量而定[25]。AFLP可采取单酶切、双酶切,据报道TE-AFLP用3种酶进行酶切反应[26]。双酶切具有DNA片段长度较小,易于分离扩增产物等优点,因此得以大量应用于试验研究。高品质基因组DNA的提取,是AFLP反应体系成功建立的关键[27],若含有质量较差的DNA时,试验结果的稳定性将会受到很大影响[28-29]。试验用于酶切的DNA经检测D260 nm/D280 nm的比值在1.7~1.9,纯度较高。琼脂糖凝胶电泳检测显示,不含RNA和其他杂质,完全达到了AFLP技术的要求。双酶切反应中,限制性内切酶对DNA的酶切必须完全彻底,否则扩增后变性聚丙烯电泳会出现多而密、中下部扩增带稀少的现象,EcoRI较MseI敏感,更容易受DNA质量和体系中各成分的影响,因此在酶切反应中,采用EcoRI酶切缓冲液作为双酶切的缓冲液。

表3 优化体系筛选条件设计及筛选结果 Table 3 Optimization system screening conditions design and screening results

筛选项筛选梯度筛选结果酶切时间/h3.03.54.04.55.05.55DNA浓度/(ng·μL-1)40506070809010090EcoRI浓度/U246810128MseI浓度/U246810126预扩增产物稀释倍数51020253040302×PCRMasterMix用量/μL6789101110

表4 预扩增正交体系设计 Table 4 Orthogonal design for pre-amplification

编号连接产物稀释倍数(4μL)PrimerE0/μLPrimerM0/μL2×PCRMasterMix/μLddH2O/μL150.60.6618.8250.80.8915.4351.01.01212.0451.21.2158.65100.60.81212.66100.80.6159.67101.01.2617.28101.21.0914.89150.61.0159.410150.81.21212.011151.00.6915.412151.20.8618.013200.61.2614.214200.81.0918.215201.00.8159.216201.20.61212.2

表5 选择性扩增引物组合编号 Table 5 Primer numbers

引物组合编号引物组合编号引物组合编号引物组合编号E2M21E3M39E3M617E7M625E3M22E5M210E7M418E7M226E4M23E4M311E3M319E7M527E5M24E5M412E2M520E3M728E6M65E7M413E4M321E6M829E7M26E2M614E6M522E7M730E7M57E2M515E5M623E4M831E2M38E4M716E6M524

注:E代表EcoRI,M代表MseI。

1.6 AFLP反应体系

1.6.1 基因组DNA双酶切 选取2种限制性内切酶EcoRI/MseI,反应体系共20 μL。包含,10×Tang buffer 3 μL,模板DNA(200~300 ng/μL)9 μL,8 U EcoRI,6 U MseI,ddH2O补平。双酶切时间,37℃水浴5 h、65℃水溶15 min。-20℃保存酶切产物。

2.2.4 MseI浓度筛选 电泳结果(图5)表明1、3条带明显亮于其他条带,3的条带亮度最大。MseI浓度筛选结果为6 U。

根据探索性调查,选取珠三角地区外籍人才需求最高的三个城市:广州、深圳、佛山的企业作为调查对象。采用非概率抽样的方式,在三地的外籍人才专场招聘会、大型招聘会以及交易博览会上,对参会企业发放纸质问卷,由调查企业的业务主管或人力资源主管填写问卷。

1.6.4 AFLP选择性扩增反应 反应总体系20 μL,包括2 μL稀释10、20、25、30、40、50倍的预扩增产物(稀释30倍);0.8 μL Primer E,1.0 μL Peimer M,2×PCR Master Mix6、7、8、9、10和11 μL;ddH2O补平后进行PCR反应。

1.6.5 扩增产物检测 制备4%变性聚丙烯酰胺凝胶,待胶聚合后预电泳30 min。选择扩增产物(2 μL)与上样Buffer混匀,经90℃变性3 min,置于4℃保存等待点样。点样后1 500 V恒功率电泳1.5 h左右,停止电泳。采用Carlos银染方法[22-23],胶版微干后拍照、统计数据。

2 结果与分析

2.1 DNA提取质量和检测

AFLP反应对DNA质量要求较高。高质量的DNA是获得重复性好、条带清晰AFLP扩增结果的关键因素。采取改良CTAB法提取红三叶基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示所提取的红三叶基因组DNA条带清晰、整齐、无拖尾(图1)。经超微量紫外分光光度计检测,D260nm/D280nm在1.7~1.9,D260nm/D230nm约为2,浓度在200 ng/μL。说明所提取DNA纯度高,浓度适中,能够达到下一步试验要求。

动物试验显示,枇杷花的醇提物可以明显延长小鼠和豚鼠的咳嗽潜伏期,减少咳嗽次数[39],还能够降低患有口腔黏膜炎症的仓鼠的细菌感染、口腔黏膜炎症血浆脂质过氧化物水平[40],说明杷花醇提物的抗炎止咳作用,其抗炎作用机理可能是通过抑制NO的产生,降低核因子NF-kB的活性来抑制诱导型一氧化氮合酶iNOS的表达[41],减少干扰素-α,白细胞介素-6和白细胞介素-8的分泌,抑制蛋白激酶MAPK和细胞外信号调节激酶EPK的活性[42,43]。

图1 红三叶基因组DNA电泳检测 Fig.1 Agarose gel-electrophporesis of redclover genomic DNA 注:1,2分别为红三叶DNA在1 %琼脂糖凝胶检测结果

2.2 酶切连接体系优化

2.2.1 酶切时间优化 采用EcoRI和MseI进行基因组DNA酶切,识别序列分别为GAATTC和AATT。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。其DNA片段均在100~1 500 bp,表明酶切充分,符合试验要求(图2)。1~5条带亮度逐渐增加,6稍暗于5。因此酶切时间选用37℃ 5 h,65℃ 20 min。

图2 酶切时间优化电泳图 Fig.2 Agarose gel-electrophporesis of gradientextracted enzyme digestion time 注:1~6分别为3,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 h酶切连接琼脂糖电泳带型,M为D2000分子量标记

2.2.2 DNA浓度筛选 40~90 ng/μL电泳条带亮度逐渐变大,100 ng/μL条带亮度暗于90 ng/μL。90 ng/μL DNA进行酶切反应(图3)。

林强信的眼睛如一盏灯,似乎能照亮我内心的阴暗。他的眼里分明打了问号,对我是不是真的辞工回家深有怀疑。林强信说,阿坤啊,我培养你这么多年,你这么做,是拆我的台呀。我谦虚地说,大发厂是艘航母,我不过是颗螺丝钉,哪有那么重要?再说,谁不知道林老板您在坑梓这个小镇上,树大根深,家大业大,谁能拆得了您林老板的台呢?我这个老实人能说出这样的话来,自我感觉临场发挥得还行。

图3 DNA浓度筛选电泳图 Fig.3 Agarose gel-electrophoresis of different DNA concentrations 注:1~7的DNA浓度分别为40、50、60、70、80、90、100 ng/μL,M为D2000分子量标记

生产过程的制造能力度量与各类资源的组织方式以及运行时间具有高关联性,在某一个工作周期内,其制造能力度量模型是一个与时间关联的函数。

1.6.3 AFLP预扩增反应 反应总体系30 μL,包括4 μL连接产物模板DNA,0.8 μL EcoRI,0.6 μL MseI预扩增引物,15 μL 2×PCR Master Mix,ddH2O补平,离心混匀进行PCR反应。

图4 EcoRI浓度筛选电泳图 Fig.4 Agarose gel-electrophoresis of different EcoRI concentrations 注:1~6的EcoRI浓度分别为2、4、6、8、10、12 U,M为D2000分子量标记

1.6.2 接头连接 合成的单链人工接头稀释至50 μmol/L,经PCR反应合成双链,加入3 U T4DNA连接酶,于22℃下连接过夜。

2.3 预扩增体系的优化

根据表2设计的16个PCR扩增结果图。整体效果不理想,仅第4与第6有条带。第6条带的亮度明显优于第4条带。因此,预扩增体系为,连接产物,4 μL(稀释10倍);Primer E0,0.8 μL;Peimer M0,0.6 μL;2×PCR Master Mix,15 μL;ddH2O,9.6 μL(图6)。

图5 MseI(Trμ9I)浓度筛选电泳图 Fig.5 Agarose gel-electrophporesis of different MseI (Trμ9I) concentration 注:1~6的MseI(Trμ9I)浓度分别为2、4、6、8、10、12 U,M为D2000分子量标记

图6 预扩增正交设计电泳图 Fig.6 Agarose gel-electrophporesis on orthogonal design of pre-amplification 注:1~16代表正交体系编号,同表4

2.4 选择性扩增体系优化

2.4.1 预扩增产物稀释倍数筛选 在众多因素中,预扩增产物稀释的倍数对选择性扩增效果的影响最大。为使条带清晰、稳定,预扩增产物被稀释不同倍作比对试验,结果显示,最适宜的扩增效果是稀释30倍(图7)。

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选择性扩增体系:预扩增产物,2 μL(稀释30倍);Primer E,0.8 μL;Primer M,1.0 μL;2×PCR Master Mix,10 μL;ddH2O,6.2 μL。

图7 预扩增产物稀释倍数处理下选择性扩增 Fig.7 Effects of pre-amplification product diluted multiples on selective amplification 注:1~6分别为5、10、15、20、25、30、40倍Mix用量,M为D2000分子量标记

图8 2×PCR Master Mix用量处理下选择性扩增 Fig.8 Effects of concentration of 2×PCRMasterMix on selective amplification 注:1~6分别为6、7、8、9、10、11 μL 2×PCR Master稀释,M为D2000分子量标记

2.4.3 引物对的筛选 从8条EcoRI酶切位点接头选择性引物和8条MseI酶切位点接头选择性引物组合共计64对选择性引物中筛选。只有1对引物组合没有扩增出条带,2对引物扩增结果与其他引物组合扩增条带重复,其余引物组合均能获得较清晰条带。其中31对引物的扩增图谱(图9)。选取16对条带清晰且条带数较多的引物组合进行后续分析。

3 讨论

体系优化筛选条件:酶切时间,DNA浓度,EcoRI、MseI浓度见表3;预扩增体系见表4,选择性扩增体系进行优化设计见表5。

图9 引物筛选电泳图 Fig.9 Agarose gel-electrophporesis of primer screening 注:M为DNA Marker(BBI Life Sciences)

AFLP反应中,不同材料的酶切时间、预扩增产物的稀释倍数和选择性扩增引物浓度这3个关键反应条件有所不同[30-31]。蔡丽艳等[11]构建苜蓿cDNA-AFLP反应体系的酶切时间为37℃ 6 h,65℃ 20 min。刘欢等[12]构建燕麦AFLP体系酶切的时间为37℃ 4 h,65℃ 15 min。引物浓度是反应体系的重要组成部分,对试验结果影响比较大[32]。如果引物浓度偏低,PCR效率也会降低,扩增产物产量也相应减少;如果引物浓度偏高,可能会发生异位引导,导致非特异性意外扩增,影响试验结果的准确性[33]。试验为2种引物分别设置了6个引物浓度梯度,并筛选出了最优浓度。

AFLP操作时,由于胶板点样口限制,同一对引物所扩增出的所有样需分批进行点样、跑胶,这就造成了不同玻璃板之间显影的差别,人工统计条带时,人为因素造成的误差会降低AFLP技术的有效性。因此,为了提高试验的精确性,试验对引物初步筛选后,选出16对引物(点样板最多点样32个)对红三叶新品系和岷山红三叶进行多样性分析,筛选出11对清晰的扩增条带且多样性丰富的引物组合进行下一步实验。

一切医学的进步和成果,都是在正视、了解疾病的基础上取得的,也正是由于死亡的存在,生命才尤显可贵,才更值得珍视与呵护——这些其实都是再也明白不过的人生公理,绝不需要任何人再以任何形式的低级错误来进行反证。

4 结论

通过对决定AFLP体系的DNA浓度,酶切时间,两酶EcoRI和MseI浓度,预扩增产物稀释倍数,2×PCR Master Mix用量,引物组合等7个要素进行筛选,逐一筛选出对应上述要素的最优化量。分别为90 ng/μL,5 h,8 U,6 U,30倍,10 μL,构建了AFLP优化体系。按照筛选结果得到31条清晰条带。并选出11条进行后续分析。

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蒲小剑,田久胜,田新会,杜文华
《草原与草坪》 2018年第2期
《草原与草坪》2018年第2期文献

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