鱼卵和仔稚鱼是鱼类生活史的早期阶段，鱼卵和仔稚鱼调查是研究鱼类繁殖习性、生殖洄游路线、产卵场、种类分布和种群动态的基础，也可为鱼类人工繁育技术和生理生化机制研究提供基础数据[1]。鱼卵和仔稚鱼种类的准确鉴别，是开展鱼卵和仔稚鱼研究的重要前提。通常，鱼卵鉴别主要依据卵的形状、大小、卵周隙、油球、内膜、绒毛膜、卵黄形态和胚胎形状等形态特征[2]，然而近缘物种的鱼卵由于形态相似很难区分，大多种类只能鉴定到科或属的水平，目前只有极少种类鱼卵鉴定到种的水平，寻求稳定、准确的分类依据和鉴定方法，是鱼类浮游生物研究亟待解决的关键问题。DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种利用标准基因区域序列多态性进行物种鉴定的分子方法，条形码序列分析不依赖于形态特征，对形态特征近似，形态学分类比较困难的疑难种类的分类以及形态学分类上存有疑问种类的验证提供了新的方法和手段[3-4]。鱼类线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(mtCOI)基因具有序列变异水平适中，变异区域两端序列高度保守和序列长度适宜的特点，是被广泛接受的鱼类DNA条形码标准基因[5-7]，目前鱼类DNA条形码数据库(Barcode of Life Data System [BOLD])中已有超过17.5万件凭证标本，代表了1.5万种以上的鱼类种类[8]。随着鱼类DNA条形码数据库的不断完善，研究证实DNA条形码技术在鱼卵和仔稚鱼的种类鉴定中也具有重要的应用价值[9-11]。

南沙群岛位于南海南部，属于印度洋-太平洋热带动物区系，是世界上海洋生物最丰富的区域之一。根据已有的调查资料显示南海鱼类有3 000多种，分别隶属于3个纲、35个目、236个科和822属[12]。目前南海鱼类中只对极少数种类的鱼卵和仔稚鱼进行过研究[4，13-14]，绝大多数种类的鱼卵和仔稚鱼的形态特征并不清楚，使得南海重要经济鱼类产卵行为、产卵场判别和种群补充机制研究无法开展。永暑礁是一座珊瑚环礁，为珊瑚礁鱼类和热带大洋性鱼类的重要产卵场，然而目前未见有关永暑礁海域鱼卵鉴定和分类的相关研究。因此，本研究拟以永暑礁泻湖鱼卵为研究对象，采用形态分类特征和DNA条形码技术对采集的鱼类进行鉴定分析，以期了解珊瑚礁鱼类和热带大洋性鱼类的产卵季节和种类分布特征，为相关种类的种群补充机制研究提供基础材料。

1 材料和方法

1.1 样品采集和形态特征分析

依托中国水产科学研究院南海水产研究所“南锋号”科学调查船，于2016年4月13号在中国南海永暑礁泻湖海域按照《海洋调查规范》(GB12763.1-7-91)进行鱼卵样品采集。采用孔径为0.505 mm筛绢制成的大型浮游生物网(网口内径80 cm、长270 cm、网口面积为0.5 m2)按照设定站位进行表层水平和垂直拖网，采集鱼卵样品，-20 ℃冰箱中保存备用。采集的样品运至实验室后，于解剖镜下进行形态特征观察和显微拍照，观察记录鱼卵的卵膜(Chorion)、围囊腔(Perivitelline space)、卵黄(Yolk)、油球(Oil globule)、色素分布(Pigmentation)和胚体发育(Embryo)等形态特征和鱼卵卵径参数，并对鱼卵形态特征进行了描述分析(表1)。

1.2 DNA提取和COI基因测序分析

鱼卵样品用双蒸水冲洗，将样品置于1.5 mL离心管中，采用Magen公司的试剂盒(HiPure Mollusc DNA Kit)提取基因组DNA，提取的DNA置于-20 ℃保存备用。引物设计参照Ward等[15],由广州睿博生物公司合成，序列扩增引物为Fish-F：5′-TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCAC-3′和Fish-R：5′-ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA-3′。PCR扩增总体积为25 μL，反应体系包括RNase-Free Water (16.7 μL)，10×loading buffer (Mg2+ free)2.5 μL，DNTP(2.5 mmol/L)2 μL，MgCl2(2.5 μmol/L)1.5 μL，Fish-F(10 μmol/L)0.5 μL，Fish-R(10 μmol/L)0.5 μL，rTaq (5 U/μL)0.3 μL及DNA模板(20 ng/μg)1.0 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1.2%的琼脂糖胶电泳检测，选取扩增结果较好的产物送广州睿博兴科股份有限公司测序分析。

由于鱼卵样品在提取DNA、PCR扩增及测序的实验过程中，都有可能会出现结果不佳的情况，因此本研究以最终获得的有效的序列个体来进行分析。

1.3 分子鉴定分析

测序获得的鱼卵COI基因序列与BOLD系统数据库(http://www.barcodinglife.org)比对分析进行物种鉴定，在比对分析中，BOLD系统为每个样品分配一个条形码索引号(Barcode Index Number，BIN)，当样品COI基因序列与BIN中参考序列的相似性≥98.4%时，鉴定为种，当相似性在95%～ 98.3%之间，鉴定到属，当相似性<95%时，为未知种[2，16]。利用MEGA6.0软件根据配对遗传距离采用Kimura two-parameter model (K2P)构建邻接进化树(Neighbor-joining tree)[17]，进化树末端节点代表了种类分组。

近年来有关鱼类DNA条形码参考序列数据库构建得到了快速发展，Díaz等[21]采集分析了79种鱼类样品，测序分析了其DNA条形码序列，构建了美洲Lower Paraná河鱼类DNA条形码参考序列数据库；Chang等[22]采集分析了1 245种鱼类凭证标本及其DNA条形码序列，构建了台湾海峡鱼类DNA条形码参考序列数据库；Weight等[23]采集分析了521种鱼类样品及其DNA条形码序列，构建了加勒比海鱼类DNA条形码参考序列数据库；中国水产科学研究院依托国家科技基础工作专项采集分析了763种南海鱼类凭证标本及其DNA条形码序列，构建了较为完备的南海珊瑚鱼类DNA条形码数据库，这些序列均已录入到BOLD条形码数据库中，这些条形码序列数据库的建立为基于DNA条形码技术开展鱼卵和仔稚鱼鉴定奠定了基础。北大西洋大陆架海域93.26%的鱼卵DNA条形码序列能够与BOLD数据库中的参考序列相匹配[8]，在加勒比海珊瑚礁海域仅有85.7%的鱼卵DNA条形码序列能够与BOLD数据库中的参考序列相匹配[2]，该研究中100%的鱼卵DNA条形码序列能够与参考数据库中的序列相匹配。这些研究结果表明DNA条形码参考数据库的完整性直接影响到鱼卵鉴定的效率。

2 结果和分析

2.1 鱼卵种类鉴定分析

近年来，由于过度捕捞和填海造岛等人类活动干扰，渔业生态环境发生改变，导致渔业资源显著减少[19]。对鱼卵进行准确鉴别是了解鱼类繁殖习性、生活史和种群动态的基础，可用于鉴别鱼卵的形态特征较少，传统的分类手段很难准确鉴别到种的水平。永暑礁为典型的珊瑚环礁，是热带珊瑚礁鱼类的重要栖息地和产卵场，目前未见有关永暑礁鱼卵分类鉴别的相关文献报道。DNA条形码技术的迅速发展，为从分子水平准确鉴定鱼卵提供了有效的手段[10,20]。从鱼卵中提取高质量的DNA用于PCR扩增，是利用DNA条形码鉴别鱼卵的前提条件，该研究分析的71个冷冻保存的鱼卵中30个成功扩增测序获得了有效的线粒体COI 序列信息，成功率为42.3%。部分鱼卵未能成功获得COI序列，可能由于鱼卵样品为冰冻保存，样品在冻融过程中降解，导致无法提取其基因组DNA，或者由于鱼卵样品体积较小，在DNA提取过程中操作不当导致样品损失，因此，鱼卵样品保存和基因组DNA的提取需要进一步的优化，提高鱼卵鉴定的检出率。有趣的是圆形鱼卵的扩增测序成功率(61.4%)显著高于椭圆形鱼卵的扩增测序成功率(11.1%)，其中原因有待于进一步研究。酒精保存鱼卵容易导致鱼卵脱水，致使鱼卵缩小变形，但是酒精保存不需要特殊的设备，容易操作，也是目前鱼卵采集过程中的主要保存方式之一，Leyva等[2]研究表明酒精保存的鱼卵DNA条形码测序成功率为46.3%，Burghart等[9]的研究表明50%的异丙醇保存鱼卵也不影响样品用于DNA条形码分析。由此可见目前鱼卵的扩增成功率并不高，如何开发高效的鱼卵保存和扩增方法是有待进一步研究的问题。

表1 13种鱼卵的形态特征 Tab.1 Morphological features of 13 species of fish eggs

物种名个数形状直径/mm卵膜围囊腔卵黄油球色素分布胚体发育其他史氏鹦哥鱼Scarusschlegeli1椭球形3 78∗1 51光滑，无色透明较宽有少量黑点，卵黄较少，部分呈弥散分布有没有没有可能为非受精卵，也可能受精卵未发育斑点鲸鹦嘴鱼Cetoscarusocellatus1球形1 69光滑，无色透明中等完整，均匀有没有有，包裹于卵黄囊中，胚体未发育成型，未能辨别形态受精卵，卵黄颜色较胚体浅单带鱼尖唇Oxycheilinusunifasciatus1球形1 69光滑较宽大多分布于中央，少数呈现弥散分布，有少量黑点有卵黄上有少量黑点不明确可能为非受精卵，也可能受精卵未发育双线尖唇鱼Oxycheilinusdigramma1球形1 41光滑，无色透明中等均匀，有少量黑点，有有少量黑斑点或块状物有，体型较小受精卵扁体栉齿刺尾鱼Ctenochaetusstrigosus1球形1 87光滑，无色透明中等均匀，弥散分布，胚体周围较多，有少量黑点有卵黄和胚体上均有少量黑点胚体弯曲状，难以观察形态特征，其上有少量黑点受精卵白面刺尾鱼Acanthurusnigricans2球形1 58光滑，无色透明较宽均匀，大多集中分布于一侧，少数弥散分布，有少量黑点有卵黄上有少量黑点不明确可能为非受精卵，也可能受精卵未发育

续表1

物种名个数形状直径/mm卵膜围囊腔卵黄油球色素分布胚体发育其他双斑栉齿刺尾鱼Ctenochaetusbinotatus10球形1 57±0 96光滑，无色透明较宽大多集中分布于一侧，少数弥散分布，有少量黑点有卵黄上有少量黑点不明确可能为非受精卵，也可能受精卵未发育白尾栉齿刺尾鱼Ctenochaetusflavicauda4球形1 52±0 019光滑窄均匀，弥散分布，中央多，四周少有不明确不明确可能为非受精卵，也可能受精卵未发育黑背鼻鱼Nasolituratus2球形1 34光滑，可见微微皱褶窄均匀有有少量黑斑点或块状物有，胚体与卵黄重叠，不能辨明头跟尾受精卵蓝圆鯵Decapterusmaruadsi2椭球形3 10±1 37光滑，无色透明较宽卵黄位于鱼卵一端且体积较小有没有没有可能为非受精卵，也可能受精卵未发育银篮子鱼Siganusargenteus2球形1 91±0 57光滑窄大多集中分布于一侧，少数弥散分布，有少量黑点有卵黄上有少量黑点不明确可能为非受精卵，也可能受精卵未发育榄色细齿笛鲷Aphareusfurca1球形1 98光滑，无色透明中等均匀，弥散分布，胚体周围较多，有少量黑点有卵黄和胚体上均有少量黑点胚体弯曲状，难以观察形态特征，其上有少量黑点受精卵镰鱼Zancluscornutus2球形1 99±0 021光滑，无色透明中等均匀，弥散分布且量较少，胚体周围集中多，有少量黑点有卵黄和胚体上均有少量黑点胚体弯曲状，难以观察形态特征，其上有少量黑点受精卵

表2 南海永暑礁海域鱼卵mtCOI序列比对结果 Tab.2 Sequences comparison results of mtCOI in fish eggs from Yongshu reef lagoon of South China Sea

物种名卵数相似度/%属科目史氏鹦哥鱼199 6鹦哥鱼属鹦哥鱼科鲈形目斑点鲸鹦嘴鱼199 7鲸鹦哥鱼属鹦哥鱼科鲈形目单带鱼尖唇199 84尖唇鱼属隆头鱼科鲈形目双线尖唇鱼1100尖唇鱼属隆头鱼科鲈形目白面刺尾鱼2100刺尾鲷属刺尾鲷科鲈形目扁体栉齿刺尾鱼1100栉齿刺尾鱼属刺尾鲷科鲈形目双斑栉齿刺尾鱼10100栉齿刺尾鱼属刺尾鲷科鲈形目白尾栉齿刺尾鱼4100栉齿刺尾鱼属刺尾鲷科鲈形目黑背鼻鱼2100鼻鱼属刺尾鲷科鲈形目蓝圆鯵2100圆鯵属鰺科鲈形目银篮子鱼299 85篮子鱼属篮子鱼科鲈形目榄色细齿笛鲷1100叉尾鲷属笛鲷科鲈形目镰鱼2100角蝶鱼属蝶鱼科鲈形目

2.2 系统进化分析

获得的30个鱼卵的线粒体COI序列长度在463～662 bp之间，序列中没有插入/缺失位点和终止密码子。根据线粒体COI序列计算种内的K2P遗传距离为0～0.002，同一个属种间的遗传距离为0.004～0.132，而同一个科不同属间的遗传距离为0.117～0.185。根据K2P模型利用遗传距离构建的邻接系统进化树显示，相同的种类聚为一个分支；刺尾鱼科中的刺尾鱼属和栉齿刺尾鱼属聚为一支，而与同一科的鼻鱼属未形成单系支(图1)。

图1 根据K2P模型利用遗传距离构建的邻接系统进化树 Fig.1 Neighbor-joining tree constructed based on K2P model

2.3 鱼卵形态特征分析

①人居环境差。泰煤家园辖区面积大，内部房屋质量参差不齐。泰煤家园共有20栋楼房，90户平房。其中4栋为筒子楼式住房，人居环境很差，但仍有居民居住；90栋为平房，为典型的城市棚户区；仅有16栋住房居住条件较好，适宜居住。②物业管理质量低。目前，泰煤家园的物业尚未完全移交社会，原属企业对社区进行物业管理的弊端逐渐凸显出来，表现为物业管理的落后。通过“居民对物业满意情况”的调查得出居民对当前物业管理水平的满意程度处于较低水平。小区内垃圾堆积，70.9%的居民对环卫不满意；路灯失修多年，照明无法满足居民日常需求，导致86%的居民对照明不满意；安全问题也得到居民普遍关切。

3 讨论

采集的71个鱼卵样品根据外部形态特征初步划分为圆形和椭圆形2种类型，圆形鱼卵44个，椭圆形鱼卵27个。经DNA提取和线粒体COI基因片段测序分析，71个鱼卵样品中的30个个体获得了有效的线粒体COI序列信息，测序成功率为42.3%。44个圆形鱼卵中有27个测序成功，测序成功率达61.4%；27个椭圆形鱼卵中有3个测序成果，测序成功率仅为11.1%。30个鱼卵线粒体COI序列分别于BOLD数据库比对分析，结果显示与BOLD数据库中参考序列相似性在99.6～100%之间，30个鱼卵均能鉴定到种的水平，分属于1个目，7个科，13个种(表1，表2)。刺尾鱼科(Acanthuridae)有5个种，分别为白面刺尾鱼(Acanthurus nigricans)、扁体栉齿刺尾鱼(Ctenochaetus strigosus)、双斑栉齿刺尾鱼(C.binotatus)、白尾栉齿刺尾鱼(C.flavicauda)和黑背鼻鱼(Naso lituratus)，共有19个鱼卵，占鉴定鱼卵总数的63.3%。鹦哥鱼科(Scaridae)有2个种，分别为史氏鹦哥鱼(Scarus schlegeli)和斑点鲸鹦哥鱼(Cetoscarus ocellatus)。隆头鱼科(Labridae)有2个种，分别为单带尖唇鱼(Oxycheilinus unifasciatus)和双线尖唇鱼(O.digramma)。鲹科(Carangidae)有1个种为蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)；篮子鱼科(Siganidae)有1个种为银篮子鱼(Siganus argenteus)；笛鲷科(Lutjanidae)有1个种为榄色细齿笛鲷(Aphareus furca)；鲽鱼科(Zanclidae)有1种为镰鱼(Zanclus cornutus)。双斑栉齿刺尾鱼有10个鱼卵，白尾栉齿刺尾鱼有4个鱼卵，这两个种为该海域的优势种类，其余各种类均为1～2个鱼卵。

通过对本次补充勘探的成果进行分析可见，QN-06V参数井预测失败应是多种不利的主客观因素全部巧合的结果，也是沁南煤层气施工中较为罕见的一例。通过QN-06V参数井施工失败的教训也得到一些启示：

根据鱼卵的形状、卵膜、围囊腔、卵黄、油球、色素分布和胚胎发育情况等形态性状，详细描述了该研究鉴定的13种鱼类的鱼卵形态特征(表1)。史氏鹦哥鱼和蓝圆鲹的鱼卵均为椭圆形，卵膜光滑，无色透明，围囊腔较宽，但是史氏鹦哥鱼卵径较大，卵黄均匀分布，而蓝圆鲹的卵黄位于鱼卵的一端，并且体积较小。其余11种鱼类的鱼卵均为圆形，鱼卵直径在1.34～1.99 mm之间，黑背鼻鱼的鱼卵直径最小，镰鱼的鱼卵直径最大。已有的研究表明海水鱼卵直径在0.5～5.5 mm之间[18]，该研究所获得的永暑礁海域鱼卵直径也处于该范围，但是比尤卡坦半岛(Yucatan Penisula)海域鱼卵直径大[2]，可能是由于其将鱼卵保存于酒精中导致鱼卵缩水造成的，而该研究是将鱼卵样品直接冷冻保存。

由于线粒体COI基因存在同义突变偏好性，不同种属间的突变率存在显著差异[24]，致使种内或种、属间的线粒体COI序列多态性存在显著差异，这种差异称为条形码间隙(Barcode gap)[25]，DNA条形码间隙的存在是利用条形码进行物种鉴定的前提，已有的关于鱼类DNA条形码研究证实鱼类种内或种、属间存在显著的条形码间隙[22,26]。该研究表明永暑礁同种鱼类间的K2P遗传距离为0～0.002，同一个属不同种间的遗传距离为0.004～0.132，属间的遗传距离为0.117～0.185，存在着明显的DNA条形码间隙，分析的所有种类在NJ进化树中均能形成单系支，证实了DNA条形码技术适用于南海珊瑚礁鱼类鱼卵和仔稚鱼鉴定。该研究中南沙珊瑚礁鱼类种内遗传距离最高仅为0.002，显著低于墨西哥尤卡坦半岛鱼类种内遗传距离(0.006)[2]和台湾海峡鱼类种内遗传距离(0.151)[21]，可能与该研究中每个种类使用鱼卵的数量较少有关，下一步应加大鱼卵采集和分析的数量，以便更准确反映种内和种属间的遗传关系。

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