PD-L1（B7-H1，CD274）是PD-1的配体，在多种细胞中均有表达，包括肿瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞和树突状细胞。PD-L1与PD-1结合并激活PD-L1/PD-1信号通路，在不同的细胞中导致不同的结果。激活T细胞的PD-L1/PD-1通路可抑制T细胞增殖、减少T细胞INF-γ和IL-12的分泌、导致T细胞衰竭和凋亡，从而导致T细胞的免疫抑制。癌细胞表达PD-L1抑制T细胞功能是癌症患者肿瘤细胞逃避免疫监视的主要机制，因此，用肿瘤细胞表面表达PD-L1作为选择接受PD-1或PD-L1抗体治疗的癌症患者的标志［1-6］。虽然有研究表明其他免疫细胞，如树突状细胞［7-10］表面也表达PD-1，但和T细胞相比，PD-L1/PD-1通路激活对其它免疫细胞影响的研究却很少。

树突状细胞是最强的抗原提呈细胞，它由骨髓祖细胞或单核细胞［11］分化而来。在肿瘤微环境中，树突状细胞的成熟是受到抑制的［12］。肿瘤组织中未成熟树突状细胞数量多提示预后较差。有研究认为树突状细胞的成熟抑制是由肿瘤细胞分泌的细胞因子所引起的［11-17］。未成熟树突状细胞通过多种机制引起肿瘤微环境中T细胞耐受［11］。除了对T细胞的影响，有研究认为，肿瘤相关树突状细胞可以通过分泌HB-EGF、CXCL5或双调蛋白促进肿瘤细胞的侵袭［18-20］。免疫组化结果显示，在肺癌组织中树突状细胞的不成熟与癌细胞PD-L1的表达相关［21］。Lim等［22］研究结果表明树突状细胞表面表达的PD-1可以抑制CD8+T细胞的功能和其抗肿瘤免疫的作用。然而，PD-L1/PD-1信号通路在树突状细胞分化成熟中起何作用未见报道。

基于以上研究背景，本研究拟探讨表达在乳腺癌细胞细胞膜的PD-L1是否通过激活树突状细胞PD-L1/PD-1信号通路抑制树突状细胞成熟。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及其培养相关试剂 MDA-MB-231、MCF-7和T47-D细胞系（ATCC）；DMEM、RPMI 1640、L-15、胎牛血清、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺（Gibco）；人单个核细胞，从健康志愿者新鲜血液分离；细胞示踪剂CMFDA（Abcam）。

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1.1.2 人单核细胞分离纯化与树状突细胞诱导分化有关试剂 淋巴细胞分离液（灏洋华科）；抗CD14+的磁珠（美天旎）；细胞因子IL-4、GM-CSF和TNF-α（R&D）。

1.2.4 PD-L1抗体与共培养MDA-MB-231和未成熟树突状细胞的孵育以及人重组PD-L1蛋白处理单独培养的树突状细胞 在共培养的预染MDA-MB-231细胞与未成熟树突状细胞中加入PD-L1抗体（10µg/mL）、同型对照抗体（10 µg/mL）和TNF-α，继续培养48 h。单独培养的单核细胞由IL-4及GM-CSF诱导4 d成为未成熟树突状细胞，再加入TNF-α和人重组PD-L1蛋白（终浓度在2 µg/mL）［26］，继续培养48h。

流式细胞仪分析表明，共培养的两种细胞可被区分为两个细胞群（数据未展示），一群为预染CMFDA的MDA-MB-231细胞，另一群为单核细胞诱导而来的树突状细胞。CD83和HLA-DR的阳性细胞百分率只在树突状细胞群中进行分析。和成熟树状突细胞对照组相比,共培养细胞中树状突细胞群HLA-DR和CD83阳性细胞的百分率下降，HLA-DR由（88.8±6.96）%降至（42.76±10.52）%，CD83由（18.36±3.07）%降至（9.93±2.74）%（图2B）。

人单核细胞在IL-4（40 ng/mL）和GM-CSF（40 ng/mL）诱导4d后可分化为不成熟的树突状细胞，其特征为低表达CD83与HLA-DR；加入TNF-α（40 ng/mL）继续诱导2d，树突状细胞分化成熟，其特征为两种表面标记的阳性细胞百分比均有上升，HLA-DR由（7.18±1.73）%上升至（76.8±4.13）%，CD83由（41.77±3.61）%上升至（99.37±0.40）%（图2A）。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌细胞系与细胞培养 MCF-7和T47-D细胞培养于DMEM，MDA-MB-231细胞培养于L-15，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素以及2 mmol/L谷氨酰胺，细胞培养于37℃含5%CO2的培养箱中。

流式细胞术检测结果（图3）显示，和成熟树状突细胞对照组比，人重组PD-L1蛋白处理可以降低树状突细胞HLA-DR和CD83阳性细胞的百分率，HLA-DR由（84.23±4.18）%降至（62.56±2.39）%，CD83由（87.26±1.54）%降至(60.67±1.63)%（P＜0.01）。

1.2.3 细胞示踪剂CMFDA预染MDA-MB-231细胞并与未成熟树突状细胞共培养 当MDA-MB-231细胞生长密度达到80%后，吸出培养基，加入含0.5µmol细胞示踪剂CMFDA［24-25］的预热培养基，预染乳腺癌细胞45 min，而后弃去染液，更换为新鲜培养基，MDA-MB-231细胞继续培养30 min。预染后的MDA-MB-231细胞用胰酶消化为单个细胞，按1∶1的比例和未成熟树突状细胞共培养48 h，培养基中含有IL-4、GM-CSF和TNF-α，用胰酶消化共培养的细胞，并用流式细胞术检测树突状细胞群表面标记。

春节期间，大气中日均PM2.5、PM10稳定达标，但1月27日000～100及2月1日100～2月2日00小时浓度超过75μg/m3。最高小时浓度出现在1月27日000，此时PM2.5瞬时浓度达142μg/m3，PM10瞬时浓度达174μg/m3。这两个时刻应该与出城及回城车辆激增有很大关系，随着车辆的减少污染维持时间短，日均值并未超标。

1.2.5 流式细胞术检测细胞膜表面蛋白 用流式细胞术检测肿瘤细胞膜表面表达的PD-L1蛋白以及树突状细胞表面的CD83和HLA-DR。流式细胞仪检测的细胞用流式细胞仪缓冲液洗2遍，随后在4℃与荧光抗体（PD-L1-APC、CD83-APC或HLA-DR-PE抗体）或同型对照抗体孵育30 min；1000 r/min 4℃离心细胞5 min弃去多余抗体并加入200µL流式细胞仪缓冲液，用BD CytoFLEX流式细胞仪进行检测，检测结果用FLowJo进行分析。

1.2.6 统计分析 所有实验均重复3次，数据表达为均数±标准差。应用SPSS21.0软件进行统计分析，两组数据之间的差异比较用独立样本t检验，多组数据之间的差异比较应用ANOVA统计方法。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3个乳腺癌细胞系细胞表面PD-L1蛋白表达的百分率

晚期肿瘤患者及照顾者的心理健康状况密切相关，针对引起心理问题的不同因素采取干预措施，能有效降低照顾者的负担，缓解晚期肿瘤患者情绪，使两者都能以健康积极的心态面对疾病，有助于提高家庭的生活质量。

  

图1 3个乳腺癌细胞系细胞膜表面PD-L1蛋白表达的百分率Fig.1 PercentagesofPD-L1expressiononcellmembraneofthe3breastcancercelllines(**P＜0.01vsMCF-7,T47-D).

2.2 MDA-MB-231细胞对共培养树突状细胞成熟的影响及PD-L1抗体对这一影响的作用

工业领域离不开满足特定复杂工况要求的润滑产品。长期以来，不合格和仿冒的特种润滑剂是行业面临的严重问题。报告显示，43%的机器故障是由不恰当或错误润滑引起。使用不合格润滑剂会损坏生产设备，缩短机器的使用寿命，对客户的设备运行造成损害。客户希望能确保订购的是正品，从而保护生产的正常运行，并且确保机器和组件保持既有性能。

1.1.3 抗体与重组人PD-L1蛋白 PD-L1抗体及同型对照抗体（Biolegend）；PD-L1-APC抗体及同型对照抗体（e-Bioscience）；CD83-APC、HLA-DR-PE以及同型对照抗体（BD）；人重组PD-L1蛋白（SinoBiological）。

和同型对照组相比，PD-L1抗体处理组树状突细胞亚群HLA-DR和CD83阳性细胞的百分比下降，HLADR阳性细胞百分比由（45.17±10.19）%升至(63.46±1.72)%，CD83的阳性细胞百分比由（10.15±2.54）%升至（16.46±2.58）%（图2B），统计结果显示PD-L1抗体组与同型对照组相比HLA-DR和CD83的阳性细胞百分比均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 人重组PD-L1蛋白对树突状细胞成熟分化的影响

1.2.2 分离人外周血单核细胞及体外诱导树突状细胞健康志愿者新鲜血液分离，用肝素抗凝，用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离人单个核细胞（PBMC），PBMC再用抗CD14+的磁珠分选出单核细胞，单核细胞培养于RPMI 1640中，含10%胎牛血清及2 mmol/L谷氨酰胺，在37℃含5%CO2的培养箱中。单核细胞用IL-4与GM-CSF诱导为未成熟树突状细胞，再加入TNF-α诱导为成熟的树突状细胞［23］。单核细胞以1×105/孔的密度种于12孔板，于第1天加入细胞因子IL-4（40 ng/mL）与GM-CSF（40 ng/mL）；于第3天更换新鲜培养基以及细胞因子；在第4天得到未成熟树突状细胞，再加入TNF-α（40 ng/mL）继续培养2 d，于第6天得到成熟的树突状细胞。

3 讨论

虽然肿瘤微环境中树突状细胞成熟受到抑制的机制已有报道，但对这一机制的认识并无定论。本研究表明，PD-L1抗体可以减弱表达PD-L1的乳腺癌细胞MDA-MB-231对共培养树突状细胞成熟分化的抑制作用，而人重组PD-L1蛋白可抑制单核细胞来源的未成熟树突状细胞向成熟分化，这些结果提示，PD-1信号通路的激活可抑制TNF-α诱导未成熟树突状细胞向成熟方向分化的过程。

在3种细胞系中，MDA-MB-231细胞表达PD-L1的阳性细胞高达99.7±0.15%，相比之下MCF-7与T47D分别为（2.85±1.77）%和（1.44±0.51）%（图1）。

PD-L1在多种肿瘤细胞表面均有表达，其中包括乳腺癌细胞［2，27-28］，PD-L1抗体也对多种实体瘤的治疗有效果［3,29］。临床实验结果表明表达PD-L1的三阴性乳腺癌对PD-L1抗体的治疗有效应［2，30-31］，疾病控制率达到25%。有研究报道乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞高表达PD-L1蛋白［32-33］，本实验的数据与之前的报道一致，即MDA-MB-231细胞膜表面高表达PD-L1蛋白，而乳腺癌细胞系MCF-7与T47D基本不表达。有报道指出，肿瘤微环境中T细胞分泌的INF-γ上调乳腺癌细胞表达的PD-L1［34-35］。单独培养的MDA-MB-231细胞表面表达PD-L1，说明肿瘤细胞膜表面组成性表达PD-L1可不依赖与肿瘤微环境中T细胞分泌的INF-γ，反而，肿瘤细胞通过组成性表达的PD-L1抑制T细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

健康化，健康已经成为企业宣传的必备卖点，例如杀菌除菌冰箱，杀菌及自清洁洗衣机，除甲醛空调，净化活水热水器等产品在市场额外吸引人的眼球。健康家电的发展还体现在特定的家电品类的高速发展上，例如空气净化器、净水器。净化器在经历了前几年的高速增长之后，市场逐渐趋于理性。另外，健康类小家电产品的增长亦是十分惊人，破壁机、原汁机、甩汁机等新兴品类倍受市场欢迎，也体现了家电市场的健康化趋势。未来，健康家电产品的市场需求仍会不断扩大。

在本实验模型中，CD14+人单核细胞可以被IL-4和GM-CSF诱导为不成熟的树突状细胞，再加入TNF-α则可诱导分化为成熟的树突状细胞；成熟的树突状细胞HLA-DR和CD83的阳性细胞比例较高。在MDAMB-231细胞与未成熟树突状细胞的接触共培养实验中，发现即使加入了TNF-α，MDA-MB-231细胞仍可以抑制树突状细胞的成熟，而加入PD-L1抗体后可以减弱这一抑制作用，部分恢复树突状细胞向成熟分化，可能的机制是，PD-L1抗体改变了树突状细胞和/或肿瘤细胞分泌的细胞因子，但另一种可能性是PD-L1抗体阻断了MDA-MB-231细胞的PD-L1，使其不能通过PD-1信号通路影响与其共培养的未成熟树突状细胞，从而减弱了MDA-MB-231细胞对树突状细胞分化成熟的抑制作用。事实上，Mu等［21］的研究表明，肺癌组织切片中，未成熟树突状细胞与PD-L1的表达相关，虽然他们没有提供更多的数据证明PD-L1可以向树突状细胞传递信号从而抑制树突状细胞的成熟分化。因有多篇论文报道树突状细胞膜表面表达PD-1［7-9,36］，所以有理由认为，PD-1信号途径的激活抑制TNF-α诱导的未成熟的树突状细胞向成熟分化。

本研究通过自由基接枝聚合反应，将丙烯酸（acrylic acid, AA）单体接枝到线性高分子聚乙烯醇上，得到共聚物 PVA-g-PAA，与交联剂季戊四醇（pentaerythritol, PER）共混作为LFP正极材料的交联型水性粘结剂，探讨了交联温度及不同PER使用量对LFP正极材料电化学性能的影响。

  

图2 MDA-MB-231细胞对共培养树突状细胞成熟分化的影响及PD-L1抗体对这一影响的作用Fig.2 Effect of MDA-MB-231 cells on maturation of co-cultured dendritic cells and the impact of PD-L1 antibody on this effect.A:Percentages of HLA-DR-and CD83-positive cells in immature and mature dendritic cells(**P＜0.01 vs imDC);B:Effects of MDA-MB-231 cells on percentages of HLADR-and CD83-positive cells in co-cultured dendritic sub-population cells and the impact of PD-L1 antibodyon these effects(**P＜0.01,*P＜0.05).

为了更进一步证明本研究的假设，即PD-L1激活树突状细胞的PD-1信号通路从而抑制树突状细胞成熟，我们将未成熟树突状细胞与人重组PD-L1共孵育，观察人重组PD-L1对未成熟树突状细胞的影响。我们的数据支持本研究的假设，即人重组PD-L1可以抑制TNF-α诱导单核细胞来源的未成熟树突状细胞向成熟分化的过程。

  

图3 人重组PD-L1蛋白对熟树突状细胞成熟分化的影响Fig.3 Effect of recombinant human PD-L1 protein on maturation differentiation of dendritic cells(**P＜0.01vsmDC).

基于本研究的数据，提出乳腺癌细胞表面表达的PD-L1可通过D-L1/PD-1信号通路抑制肿瘤微环境中的树突状细胞成熟，因此导致肿瘤微环境中的树突状细胞不能提呈抗原或使不成熟树状突细胞行使其他功能。PD-L1抗体对三阴性乳腺癌患者疗效的部分原因是抗体可以阻断乳腺癌细胞表达的PD-L1，从而削弱其对肿瘤微环境中树突状细胞成熟的抑制作用。

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