根据最新的国内肿瘤调查数据，肺癌仍是国内发病率最高的恶性肿瘤［1］。虽然目前肺癌治疗的手段增多、临床疗效明显提高，但因其高转移性导致病人生存期和预后仍不理想［2-3］。因此，进一步探讨肺癌转移的机制，是目前肺癌研究的重点。脂肪酸转运蛋白4（FABP4）是细胞内脂肪酸代谢的重要蛋白［4-5］，新近的研究发现其还可促进宫颈癌［6］、肝癌［7］等细胞增殖、转移。研究还发现，其表达水平和肺癌的预后相关［8］，但其与肺癌细胞转移的关系目前鲜有报道。miRNA是调控细胞内蛋白表达的重要因子［9-10］，miRNA是否通过调控FABP4表达影响肺癌的转移，目前尚未见报道。因此，本研究皆指在探讨FABP4对肺癌细胞转移能力的影响并研究靶向FABP4的miRNA。

1 材料和方法

1.1 材料

FABP4兔来源多克隆一抗（CST，美国），β-actin鼠来源单克隆一抗（CST，美国），抗兔或鼠HRP标记二抗（中杉金桥，北京），胰蛋白酶（吉诺公司，中国），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco，美国），Transwell小室（Corning，美国），新霉素和嘌呤霉素（Sigma，美国），Trizol试剂（Invitrogen，美国）；SYBR Green Real-time PCR MasterMix（Roche，美国）。

1.2 细胞培养

肺癌细胞株L9981、A549、PC13、NL9980、H661和95C由本实验室保存细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO2的37℃孵箱中培养。

1.3 shRNA质粒转染

shRNA质粒由上海吉玛生物公司合成。质粒系列参考Wang等［11］的报道，shFABP4-1 sense，5'-CACGAGA GAUUUAUGAGAdTdT-3'和 antisense，5'-UCUCUCA UAAACUCUCGUGdTdT-3'；shFABP4-2 sense，5'-GC AUGGCCAAACCUAACAUTdT-3'和antisense，5'-AU GUUAGGUUUGGCCAUGCdTdT-3'；shFABP4-3 sense，5'-GGGAACCUUUCCACACUAUTT-3'和 antisense，5'-AUAGUGUGGAAAGGUUCCCTT-3'；NC sense，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'和 antisense，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。NL9980细胞转染按lip-2000的说明书进行。转染48 h，与新霉素0.15 μg/mL筛选，直至荧光显微镜下95%以上的细胞有荧光，Westernblot检测蛋白水平。

在并购的过程中，支付方式是影响收购企业的资本结构的一个重要因素，是并购双方需要重点考虑的问题。目前的支付方式主要有：现金支付、股票支付、资产置换支付、债权支付以及混合支付等方式。与此同时，中国的并购市场在进行着不断的创新，2016年2月，中国证监会以书面形式传达了未来并购重组监管的五大方向，其中之一就是“支持并购重组创新，研究并购重组支付创新方式，引入优先股和私募可交换债等方式”。由此可见，支付方式的多元化已经成为不可逆转的趋势。

微生态制剂最早提出于美国，在微生态学原理的指导下，有益微生物主要通过动物或自然界分离鉴定以及生物工程合成实现，在工艺作用下，微生态制剂中含有诸多有益菌，属于一种活菌制剂。代谢产物与生长促进因子也是微生态制剂中的组成部分，作用于动物肠道后，有助于抑制有害微生物，并促进免疫功能的强化，进而优化饲料转化率，并促进动物生产性能的提升。

1.4 慢病毒转染

NL9980细胞转染miR-203模拟物后，FABP4蛋白表达下降（图4A），其转移能力也显著下降（图4B）；但转染靶位点突变的FABP4（MUT）后，NL9980细胞FABP4蛋白表达增加不能被miR-203抑制（图4A），同时miR-203过表达导致的转移能力下降也被抑制（图4B）。而在低转移能力的A-549细胞转染miR-203抑制物后，FABP4蛋白表达增加（图4C），细胞转移能力显著增强（图4D）。

1.5 ELISA检测

选择不同转移能力的肺癌细胞株L9981、A549、PC13、NL9980、H661和95C，检测FABP4表达情况。通过ELISA检测培养基上清中FABP4的表达，结果显示低转移能力的L9981、A549、PC13分泌FABP4的水平较高转移能力的NL9980、H661、95C减少（图1A）；同时，细胞内FABP4蛋白表达水平在高转移能力的NL9980、H661、95C中较低转移能力的L9981、A549、PC13显著增加（图1B、C）。

1.6 Westernblot检测

通过shRNA技术降低高转移能力并高表达FABP4的NL9980细胞的FABP4表达后（图2A、B），其转移能力被显著抑制（图2C、D）；而低转移能力并低表达FABP4的A549细胞中，过表达FABP4后（图2E、F），其转移能力显著提高（图2G、H）。

1.7 Transwell检测

50 mg/LMatrigel 1∶5稀释液，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。使用前用上室加入100μL无血清培养基DMEM37℃湿化30min。细胞消化后用无血清培养基DMEM制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL。吸取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM600μL。18h后取出小室，去除培养基，4%多聚甲醛固定10 min后，结晶紫染色2h，显微镜下拍照。

1.8 荧光素酶报告系统

由广州赛哲生物公司设计和合成带荧光酶的质粒，方法参考Zhang等［12］文献报道。转染NL9980细胞。参考 Hidaka等［13］的方法，在24孔板中加入PLB裂解液100 μL，常温下裂解30 min后收集于一干净的EP管中。将样品加入白色96孔板中，加入Luciferase Assay BufferⅡ后酶标仪检测荧光值Luc1，再加入Stop&Glo®Buffer检测荧光值Luc2。Luc1/Luc2即为检测值。

1.9 Q-PCR检测miRNA

通过miRNA数据网站（http：//www.microrna.org/）预测靶向FABP4的miRNA［14］，结果显示有miR-129、miR-155、miR-186、miR-203、miR-204、miR-205、miR-211、miR-361、miR-495和miR-539，通过文献查询发［15］现miR-155［15］、miR-205［16］、miR-211［17］和miR-495［18］有促进肿瘤生长转移的作用，而其他抑制肿瘤生长转移。结合FABP4促进肺癌转移，而miRNA能靶向FABP4而抑制其表达的作用，故选择检测抑制肿瘤生长转移的miR-129、miR-186、miR-203、miR-204、miR-361 和miR-539。首先，Q-PCR检测发现，miR-203、miR-361和miR-539在高转移能力的肺癌细胞中表达较低转移的显著减少（图3A～F）。用合成的miRNA模拟物转染NL9980细胞后，发现miR-203、miR-204和miR-361能显著抑制FABP4的表达；其中，miR-203的抑制效果最好（图3G、H）。因此，下一步实验用miR-203进行。通过miRNA数据网站（http：//www.microrna.org/）预测miR-203靶向位点（图3I），构建miR-203靶向FABP4位点突变的带荧光素酶报告系统的质粒（MUT），通过荧光素酶报告系统验证miR-203靶向FABP4的位点，提示转染miR-203模拟物后，靶向位点突变组荧光下降较对照组没有变化（图3J）。

1.10 miRNA转染

红河屏边供电局对10千伏及0.4千伏隐患、缺陷消除工作高度重视，为进一步加强现场作业安全风险管控，严谨现场安全管理措施，从细处入手、从严管理，切实把各项安全措施落到实处，从源头上防范作业风险，坚决杜绝违章、麻痹大意和随意性，避免出现人员思想松懈、履职不到位，要严守安全线，杜绝安全事故的发生。

miRNA模拟物和抑制物（inhibitor）购至广州锐博生物公司，按lip-2000的说明书进行转染。

1.11 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件，利用Levene方法进行方差齐性检验，确定方差齐性后，采用单因素方差分析法，整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多重比较，多重比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同转移能力的肺癌细胞FABP4的分泌和表达水平

以含1%BSA的PBS溶液为封闭液，350 μL/孔，室温封闭1 h。封闭结束后，弃去封闭液，洗板，加入待测样品(细胞培养基上清液，制作标准曲线以标准Purified Rat IgG 代替样品)100 μL，室温25±2℃孵育2 h。一抗孵育结束后，洗板，每孔加Anti-Rat IgG-HRP Antibody 100 μL，室温孵育2 h。酶标二抗孵育结束后，洗板，每孔加入TMB底物溶液100 μL，室温避光显色30 min后，每孔加入2 mol/LH2SO450 μL终止反应。用酶标仪处检测A450nm值。绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品浓度。

2.2 FABP4对肺癌细胞转移能力的影响

提取全细胞蛋白，按体积的1/4加入5×loading buffer，沸水煮10 min蛋白变性后-20℃保存。SDSPAGE胶分离蛋白（80 V 0.5 h后换100 V 1 h），转膜（冰浴，90 V 1.5 h）。封闭（5% 脱脂奶粉，室温，2 h），5%BSA稀释FABP4、β-actin一抗（1∶1000）4℃过夜孵育，TBST 5 min/次×3次。二抗（1∶5000）常温 1 h，TBST5 min/次×3次洗膜后ECL显影。

2.3 miR-203对肺癌细胞FABP4表达的影响

胰酶消化收集L9981、A549、PC13、NL9980、H661和95C细胞，Trizol重悬后-80℃保存。冷冻后样品交付广州锐博生物公司，其负责miR-129、miR-186、miR-203、miR-204、miR-361和miR-539的检测。反馈数据按2-△△法进行计算。

  

图1 FABP4在肺癌细胞中的表达水平Fig.1 Expression of FABP4 in lung cancer cells.A: ELISAresults; B, C:Western blotting results and quantitative analysis.*P＜0.05.

  

图2 FABP4对肺癌细胞转移能力的影响Fig.2 Effect of FABP4 on lung cancer cell metastasis.A:FABP4 expression detected by Western blotting in NL9980 cells transfected with shRNA;B:Trans well assay for assessing metastasis of NL9980 cells with FABP4 knockdown mediated by shFABP4-2;C:Western blotting of FABP4 expression in A549 cells were transfected with FABP4-overexpressing lentivirus(O-FABP4);D:The metastasis of A549 cells with FABP4 over expression was detected by Trans well assay.NC:Normalcontrol.*P＜0.05.

  

图3 miR-203对肺癌细胞FABP4表达的影响Fig.3 Effect of miR-203 on FABP4 expression in lung cancer cells.The expressions of miR-129(A),miR-186(B),miR-203(C),miR-204(D),miR-361(E)and miR-539(F)in lung cancer cells were tested by Q-PCR.G,H:FABP4 expression in NL9980 cells transfected with miRNA mimics;I:Prediction of miR-203 target sites via miRNA Data Website(http://www.microrna.org/);J:NL9980 cells transfected with the luciferase reporter system-targeting plasmid(MUT)for miR-203-mediated targeted FABP4 sitemutation.*P＜0.05.

2.4 miR-203靶向FABP4抑制肺癌细胞的转移

过表达FABP4蛋白的慢病毒由上海和元生物公司合成。按慢病毒滴度和细胞比1∶25进行转染A549细胞，48 h后给予嘌呤霉素（500 ng/mL）筛选，直至荧光显微镜下95%以上的细胞有荧光，Western blot检测蛋白水平。

为了从根本上提高中小零售企业电子商务商业运营模式的市场价值，企业要结合相关性因素对具体问题进行具体分析，并且针对相应的指标建立对应的管理机制，从创新和发展的角度出发提高电子商务发展转型水平，有效整合创新机制和管理流程，维护管控工作的基本效率。最重要的是，要从思想意识层面形成创新动力，优化创新化产品销售路径和宣传媒介，维护中小零售企业经济运行综合水平。

On October 28, the Department of State informed their Embassy in India, that in dealing with the matter of the Tibetan Trade Mission’s visit to the United States:

  

图4 miR-203靶向FABP4抑制肺癌细胞的转移Fig.4 miR-203 targets FABP4 to inhibit lung cancer cell metastasis.Mutant FABP4(MUT)of the target site and miR-203 mimics were co-transfected into NL9980 cells,and the expression FABP4(A and B)and metastasis(C and D)were detected by Western blotting and Trans well assay,respectively.After transfection ofA549 cells with miR-203 inhibitor,Western blotting and Trans well assay were performed to detect the expression of FABP4(Eand F)and metastasis(Gand H).NC:Normal control.Scalebar:100μm.*P＜0.05.

3 讨论

FABP4是一类重要的脂类伴侣，是脂质在细胞中代谢的重要蛋白［19］。研究发现，FABP4可提高乳腺癌细胞ROS水平促进其增殖［20］，也可诱导卵巢癌细胞EMT进而促进细胞的侵袭［6］；大规模临床研究还发现FABP4与非小细胞肺癌［8］、胰腺导管癌［21］等的疾病进展有非常密切的关系。本研究通过检测肺癌细胞系FABP4表达水平，发现低转移能力的L9981、A549、PC13培养基中FABP4的水平较高转移能力的NL9980、H661、95C低；同时，细胞内FABP4蛋白表达水平在高转移能力的NL9980、H661、95C中较低转移能力的L9981、A549、PC13显著增加。进一步在肺癌细胞系中降低或过表达FABP4，都显著影响细胞的转移能力。由此说明，FABP4可调控肺癌细胞的转移。

miRNA是一类大小为20～25个核苷酸的非编码小RNA，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等［22］。miRNA在肿瘤增殖、转移等中的作用已被大量证实［23-24］。既有研究发现miRNA在肺癌组织中表达增加，可促进肺癌的增殖、侵袭转移［25］；也有研究发现miRNA可抑制肿瘤发展重要蛋白的表达而抑制其增殖、侵袭转移，但表达水平被显著抑制［26］。本研究发现可靶向FABP4的miR-129、miR-186、miR-203、miR-204、miR-361和miR-539中miR-203、miR-361和miR-539的表达在高转移性的肺癌细胞中表达显著减少。过表达miR-203后可显著抑制NL9980的侵袭转移能力；而抑制miR-203后，A549细胞的转移能力被显著增加，这与他人在肺癌上的研究结果一致［27］。

进一步的结果还显示除了他人报道的miR-203除了靶向RGS17［28］、LASP-1［29］等来抑制肺癌的发生发展外，本研究发现其还可以显著抑制FABP4的表达。肺癌细胞转染突变miR-203靶点的FABP4后，其转移能力被miR-203抑制减少。由此提示，FABP4是miR-203抑制肺癌细胞转移的一个重点靶点。综上可以说明FABP4可以抑制肺癌细胞的转移，而miR-203可以靶向FABP4抑制肺癌细胞的转移，这也许能为肺癌转移的诊疗提供一个新的靶点。

参考文献：

［1］陈万青,郑荣寿,张思维,等.2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析［J］.中国肿瘤,2017,26(1)：1-7.

［2］Jin L,Chun J,Pan C,et al.The PLAG1-GDH1 axis promotes anoikis resistance and tumor metastasis through CamKK2-AMPK signaling inLKB1-Deficientlung cancer［J］.MolCell,2018,69(1)：87-99.e7.

［3］毛 楠,何关生,饶进军,等.沉默Bmi-1表达可逆转肺癌细胞对顺铂的耐药性［J］.南方医科大学学报,2014(7)：1000-4.

［4］Chang L,Zhang J,Liu L,et al.Fatty acid binding protein 4 is associated with stroke risk and severity in patients with acute ischemicstroke［J］.JNeuroimmunol,2017,311(7)：29-34.

［5］HertzelAV,Xu H,Downey M,et al.Fatty acid binding protein 4/aP2-dependent BLT1R expression and signaling［J］.J Lipid Res,2017,58(7)：1354-61.

［6］Jin J,Zhang Z,Zhang S,et al.Fatty acid binding protein 4 promotes epithelial-mesenchymal transition in cervical squamous cell carcinoma through AKT/GSK3β/Snail signaling pathway［J］.Mol Cell Endocrinol,2018,461(4)：155-64.

［7］Thompson KJ,Austin RG,Nazari SS,et al.Altered fatty acidbinding protein 4(FABP4)expression and function in human and animal models of hepatocellular carcinoma［J］.Liver Int,2017,24：.doi：10.1111/liv.13639.

［8］Tang ZY,Shen Q,Xie H,et al.Elevated expression of FABP3 and FABP4 cooperatively correlates with poor prognosis in non-small celllungcancer(NSCLC)［J］.Oncotarget,2016,7(29)：46253-62.

［9］Castro D,Moreira M,GouveiaAM,et al.MicroRNAs in lung cancer［J］.Oncotarget,2017,8(46)：81679-85.

［10］Zhou Q,Huang SX,Zhang F,et al.MicroRNAs：A novel potential biomarker for diagnosis and therapy in patients with non-small cell lungcancer［J］.CellProlif,2017,50(6)：35.

［11］Wang Q,Shi G,Teng Y,et al.Successful reduction of inflammatory responses and arachidonic acid-cyclooxygenase 2 pathway in human pulmonary artery endothelial cells by silencing adipocyte fatty acid binding protein［J］.JInflamm(Lond),2017,14(8)：8.

［12］Zhang Z,Liu X,Feng B,et al.STIM1,a direct target of micro RNA-185,promotes tumor metastasis and is associated with poor prognosis incolorectal cancer［J］.Oncogene,2014,34(37)：4808-20.

［13］Hidaka H,Seki N,Yoshino H,et al.Tumor suppressive microRNA-1285 regulates novel molecular targets：aberrant expression and functional significance in renal cell carcinoma［J］.Oncotarget,2012,3(1)：44-57.

［14］Marchi S,Lupini L,Patergnani S,et al.Down regulation of the mitochondrial Calcium uniporter by cancer-related miR-25［J］.Curr Biol,2013,23(1)：58-63.

［15］Gao Y,Liu Z,Ding Z,et al.MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3［J］.Oncol Lett,2018,15(4)：4781-8.

［16］Tao Y,Song Y,Han T,et al.miR-205 regulation of ICT1 has an oncogenic potential via promoting the migration and invasion of gastric cancer cells［J］.Biomed Pharmacother,2017,96(8)：191-7.

［17］Kang M,Shi J,Peng N,et al.Micro RNA-211 promotes non-smallcell lung Cancer proliferation and invasion by targeting MxA［J］.OncoTargetsTher,2017,10(7)：5667-75.

［18］Wei T,Zhu W,Fang S,et al.miR-495 promotes the chemoresistance of SCLC through the epithelial-mesenchymal transition via Etk/BMX［J］.Am J Cancer Res,2017,7(3)：628-46.

［19］Xiong X,Zhang C,Zhang Y,et al.Fabp4-Cre-mediated Sirt6 deletion impairs adipose tissue function and metabolic homeostasis inmice［J］.JEndocrinol,2017,233(3)：307-14.

［20］Guaita-Esteruelas S,Bosquet A,Saavedra P,et al.Exogenous FABP4 increases breast cancer cell proliferation and activates the expression of fatty acid transport proteins［J］.Mol Carcinog,2017,56(1)：208-17.

［21］Luo Y,Yang Z,Li D,et al.LDHB and FABP4 are Associated with progression and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinomas［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol,2017,25(5)：351-7.

［22］Schueller F,Roy S,Vucur M,et al.The role of miRNAs in the pathophysiology of liver diseases and toxicity［J］.Int J Mol Sci,2018,19(1)：78.

［23］Shenouda SK,Alahari SK.Micro RNA function in cancer：oncogene oratumor suppressor［J］.Cancer Metastasis Rev,2009,28(3/4)：369-78.

［24］Trang P,Weidhaas JB,Slack FJ.MicroRNAs as potential cancer therapeutics［J］.Oncogene,2008,27(Suppl2)：S52-7.

［25］TangYT,CuiYY,Li ZP,et al.Radiation-induced miR-208a increases the proliferation and radioresistance by targeting p21 in human lung cancercells［J］.J Exp Clin Cancer Res,2016,35(11)：7.

［26］Xia M,Duan ML,Tong JH,et al.MiR-26b suppresses tumor cell proliferation,migration and invasion by directly targeting COX-2 in lungcancer［J］.Eur Rev Med PharmacolSci,2015,19(24)：4728-37.

［27］Zheng XB,Chen XB,Xu LL,et al.miR-203 inhibits augmented proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma residual in the promoted regenerating liver［J］.Cancer Sci,2017,108(3)：338-46.

［28］Chi Y,Jin Q,Liu X,et al.miR-203 inhibits cell proliferation,invasion,and migration of non-small-cell lung cancer by downregulating RGS17［J］.Cancer Sci,2017,108(12)：2366-72.

［29］Zheng J,Wang F,Lu S,et al.LASP-1,regulated by miR-203,promotes tumor proliferation and aggressiveness in human non small cell lung cancer［J］.Exp Mol Pathol,2016,100(1)：116-24