精子的发生过程是一种多阶段的细胞分化过程，主要涉及生精细胞的生长、分裂、分化和信号传递等，受一系列基因表达调控[1]。研究表明，精子在附睾中成熟时，精子表面存在有许多去能因子，主要包括DF糖蛋白、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、质膜脂肪酸结合蛋白和内源性NYD-SP27，这些去能因子对受精的顺利进行至关重要；精子发生和精子形成过程中，NYD-SP27主要是作为一种磷脂酶C(phospholipase C,PLC)的抑制剂存在，其作用是抑制精子过早获能和自发性顶体反应，维持获能和顶体反应前精子顶体膜的完整性和稳定性；NYD-SP27在获能过程中的丢失使PLC发挥作用。在精子的获能和顶体反应过程中PLC扮演着重要的角色。

RNA干扰主要是通过靶基因的表达沉默而产生相应功能型缺失，主要是属于转录后水平的基因沉默现象。近年来RNA干扰技术主要广泛用于基因功能研究、药物靶点筛选、癌症研究及转基因动物研究等相关研究中[2-6]。目前，RNA干扰技术作为一种后基因组时代的下调基因表达的工具而广泛用于基因功能研究以及疾病治疗[7]，而哺乳动物各类细胞在转染含有连接干扰片段的慢病毒载体后可实现稳定而有效的RNA干扰[8-9]。本研究通过目的基因shRNA的设计和合成，将shRNA片段连接至慢病毒载体中，包装成慢病毒，收集病毒液感染靶细胞，然后经过实时荧光定量检测和分析，筛选出高效的干扰片段，为进一步在NYD-SP27基因的表达机制方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体及细胞 HEK-293FT细胞由中国科学院上海细胞库提供；BHK-SP27-21细胞系由作者所在实验室保存；pLentiLox3.7 (pll3.7)载体(带有绿色荧光蛋白的慢病毒干扰载体)、pLentiLox3.7 (pll3.7)相关包装辅助质粒(辅助质粒pRSV-Rev、pCMV-VSVG 和pMDLg/pRRE)由新疆畜牧科学院生物技术研究中心刘明军研究员惠赠。

1.1.2 主要试剂和设备 质粒小提试剂盒、蛋白彩虹Marker，北京康为生物技术公司产品；荧光染料SYBR Green Master Mix 试剂盒，瑞士Roche公司产品；HpaⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、Solution Ⅰ、DNA Marker、聚凝胺，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 Light Cycler® 480 Ⅱ 型实时荧光定量 PCR仪，Roche，LightCycler® 480；二氧化碳培养箱，Thermo，Forma SeriesⅡ；核酸定量仪，Thermo，Nanodrop 2000c。

1.2 方法

④筛选出干扰效率高的干扰片段，用于进一步的p53功能研究和后续实验中iPSC诱导过程。

1.2.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测绵羊NYD-SP27的相对表达量 ①根据GAPDH(登录号：NM-001190390)和P2A-Flag-NYDSP27基因序列设计实时荧光定量 PCR 的引物，引物由北京华大基因公司合成。其序列为:NYDSP27-qPCR-F：GGACTACAAAGACGATGACGACA；NYDSP27-qPCR-R：TTCAAATGACATCTGGTGTGCTT；GAPDH-qPCR-F：TGAACCACGAGAAGTATAACAACACC；GAPDH-qPCR-R：TAAGTCCCTCCACGATGCCAAAG。

表1 RNA干扰片段序列

Table 1 Sequences of short hairpin RNAs

干扰片段Interference fragment合成引物Synthetic primers序列(5'-3')Sequence(5'-3')NYDSP27-shRNA-1NYDSP27-shRNA-1FAACGGAAATTGACTGCTGGGATTCAAGAGATCCCAGCAGTCAATTTCCTTTTTTCNYDSP27-shRNA-1RTCGAGAAAAAAGGAAATTGACTGCTGGGATCTCTTGAATCCCAGCAGTCAATTTCCGTTNYDSP27-shRNA-2NYDSP27-shRNA-2FAACGGCCCTATCTGATCTTGTTATTCAAGAGATAACAAGATCAGATAGGGCCTTTTTTCNYDSP27-shRNA-2RTCGAGAAAAAAGGCCCTATCTGATCTTGTTATCTCTTGAATAACAAGATCAGATAGGGCCGTTNYDSP27-shRNA-3NYDSP27-shRNA-3FAACGGCAGCCAGGGAATTTATTTCAAGAGAATAAATTCCCTGGCTGCCTTTTTTCNYDSP27-shRNA-3RTCGAGAAAAAAGGCAGCCAGGGAATTTATTCTCTTGAAATAAATTCCCTGGCTGCCGTTNYDSP27-shRNA-4NYDSP27-shRNA-4FAACGCAACAAGAGCTGACTCTTCTTCAAGAGAGAAGAGTCAGCTCTTGTTGCTTTTTTCNYDSP27-shRNA-4RTCGAGAAAAAAGCAACAAGAGCTGACTCTTCTCTCTTGAAGAAGAGTCAGCTCTTGTTGCGTTNC -shRNANC -shRNA-FAACTTCTCCGAACGTGTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTCNC -shRNA-RTCGAGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAAGTT

1.2.2 慢病毒干扰载体构建 ①将合成的引物稀释至50 μmol/L，各取5 μL充分混匀后，添加10 μL的ddH2O，用PCR仪器95℃ 4 min，然后关闭电源，自然冷却至室温，吸取1 μL用20 g/L琼脂糖凝胶电泳验证，将剩余的合链产物于-20℃保存备用。②将保存好的PLL3.7菌液接种至含有氨苄抗性的20 mL的LB培养基中，37℃、180 r/min过夜振荡培养。③收集PLL3.7菌液，质粒小提试剂盒提取质粒，用核酸定量仪Nanodrop 2000c测定浓度，置-20℃保存备用。④将提取的pll3.7质粒载体用限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切，双酶切体系为： PLL3.7质粒8.0 μL，K buffer 2.0 μL，HpaⅠ 1.0 μL，XhoⅠ 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL，37℃酶切4 h，取2 μL用琼脂糖凝胶电泳验证，如果酶切彻底则按照TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0的说明书进行纯化，将验证后的双酶切质粒置-20℃保存备用。⑤将退火合链后的4组干扰片段分别连接至双酶切的PLL3.7中。连接体系为：NC-shRNA/NYDSP27-shRNA-1/2/3/4 2.0 μL，T4连接酶 1 μL，10×T4连接酶buffer 1 μL，PLL3.7纯化产物 1 μL，DdH2O 5 μL，16℃过夜连接。 ⑥第2天，将连接产物转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，冰浴30 min；42℃水浴热激90 s；加入适量液体LB于EP管中， 37℃、180 r/min振荡培养 1 h；8 000 r/min离心2 min，弃上清，将留有少许上清的重悬沉淀均匀涂布到氨苄抗性固体LB培养板，37℃静置培养12 h～16 h。 ⑦每个培养板挑取5株单克隆菌落至20 mL含有氨苄抗生素的液体LB培养基中，37℃、180 r/min过夜振荡培养。⑧500 mL/L甘油保存菌液，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。

1.2.3 慢病毒包装 ①大提质粒：将测序完全正确的慢病毒干扰载体pLL3.7-NC-shRNA、pLL3.7-NYDSP27-shRNA-1、pLL3.7-NYDSP27-shRNA-2和pLL3.7-NYDSP27-shRNA-3 和pLL3.7-NYDSP27-shRNA-4及辅助质粒(VSVG、pMDL 和 REV)菌液至20 mL的含有氨苄抗性的LB培养基活化，转接到300 mL含有终浓度为50 μg/mL氨苄抗生素液体LB培养基中，37℃、180 r/min过夜振荡培养。②按照说明书进行大提质粒，使用Nanodrop 2000c进行核酸定量测定所提取质粒的浓度及纯度，将大提的质粒进行稀释，稀释后的浓度为1 μg/μL。③由于293FT细胞为半贴壁细胞，贴壁效果不牢因此转染前1 d，10 cm细胞培养皿被1.0 g/L明胶过夜包被。④将复苏后的HEK-293FT细胞培养3代后，将6×106个细胞传于被明胶包被过的10 cm细胞培养板中，37℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中静置1 h或过夜。⑤转染前2 h～4 h内，更换为没有抗性的培养液，沿培养皿侧壁缓缓地加入8 mL用无抗性的含有100 mL/L FBS的完全培养液换液。⑥转染前先制备转染复合物，分别取10个1.5 mL无菌EP管分别标注为A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和B-1、B-2、B-3、B-4、B-5分别向A系列管和B系列管中加入200 μL 和220 μL无血清 DMEM 培养基，慢病毒包装体系为A系列(A-1、A-2、A-3、A-4、A-5)管中加入50 μL lip2000转染试剂，向B系列(B-1、B-2、B-3、B-4、B-5)管中依次加入相对应的PLL3.7-NYDSP27-shRNA 12 μg；PCMV-VSVG 6 μg；PCMV-VSVG 6 μg；PRSV-REV 6 μg无内毒素质粒。将A管和B管中的混合物混合均匀后，静置20 min。⑦转染:将A-1、A-2、A-3、A-4和A-5中的转染复合物逐滴加入到含有细胞和无血清DMEM的培养基中，轻轻前后摇晃培养皿混匀复合物，37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育4 h～6 h，记为转染0 h。⑧根据具体情况选择合适时长，通过荧光倒置显微镜来确定HEK-293FT 的实际转染情况，用注射器吸取培养板中含病毒颗粒的细胞上清液用0.45 μm滤器过滤，然后将收集的病毒用15 mL 100 ku超滤管离心浓缩，离心机设置4℃、6 000 r/min离心20～60 min(可浓缩10倍)。得到慢病毒 NC-LV、 shRNA-1-LV、shRNA-2-LV、 shRNA-3-LV、shRNA-4-LV、 shRNA-3-LV，将浓缩的病毒暂时4℃保存备用。

1.2.4 慢病毒滴度测定(GFP荧光计数法) ①在细胞培养板中接入一定量的细胞量，本研究以3×105细胞/孔的密度将HEK-293FT细胞接种到1 g/L明胶包被的6孔细胞培养板中，同时加入浓缩后的慢病毒悬液10 μL和相应量的助转剂聚凝胺Polybrene(终浓度为 8 μg/mL)， 轻柔画8字摇晃混匀后，将培养板放置到培养箱中继续培养。②当慢病毒感染靶细胞BHK-21细胞48 h后，将细胞消化，制成细胞悬液，滴加10 μL到细胞计数板上，通过cellMeater仪器运用测定绿色荧光转染效率的程序测定绿色荧光蛋白表达的细胞数和细胞总数的比值。③慢病毒滴度计算公式为：

病毒滴度(IU/mL)=[(绿色荧光蛋白表达的细胞数/细胞总数)/加入病毒悬液体积]×1.5×105×103。

②用特异性实时荧光定量引物扩增目的基因，NC-LV侵染靶细胞作为阴性对照，GAPDH基因作为内参基因；严格按照LightCycler® 480 SYBR Green Ⅰ Master试剂盒说明书的步骤，实时荧光定量PCR仪检测目的基因NYD-SP27 mRNA相对水平，每个样本每个基因进行3次平行试验。

《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）》明确指出，信息技术对教育发展具有革命性影响，必须予以高度重视。纲要在第十九章中明确指出要加快教育信息化进程，把教育信息化纳入国家信息化发展整体战略，超前部署教育信息网络。各高校根据相关文件不断提出要继续推进校园信息化建设，逐步建成“智慧校园”。

1.2.5 慢病毒感染靶细胞 ①感染靶细胞前消化生长状态良好的BHK-SP27-21细胞，然后按照细胞传代的方法接种细胞，按照2×105个/孔接种6孔细胞培养板，在培养液中同时加入包装出的相应慢病毒颗粒NC-LV、shRNA-1-LV、shRNA-2-LV、shRNA-3-LV、shRNA-4-LV、 shRNA-3-LV慢病毒悬液(MOI=10)，按照体积比1∶1000加入聚凝胺(Polybrene)，终浓度为1 μg/mL，最后将培养板置于37℃、体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱中培养。②当慢病毒感染靶细胞达到24 h后，弃去慢病毒液，此时记为感染0 h，用无菌PBS清洗细胞3次，加入完全培养基常规培养细胞，当感染的时间达到48 h后，用移液器吸弃培养基，使用0.1 mol/L PBS洗涤细胞1～2次；加入1 mL Trizol细胞裂解液，小心吹起细胞，转移至 1.5 mL DNase/RNase-free离心管中，振荡混匀，按说明书用超纯RNA提取试剂提取RNA，测定总RNA浓度及纯度，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书反转录cDNA，通过测定浓度判定DNA的品质后将cDNA保存待用。

-(对照组目的基因CT值-对照组内参基因CT值)]

工业控制系统信息安全近几年才被广泛重视，处于起步阶段，许多工控企业管理制度不健全，应急响应机制欠缺，人员配置缺乏，人员培训不足等，均对工业控制系统信息安全构成了威胁。

③以NC-LV、shRNA-1-LV、shRNA-2-LV、shRNA-3-LV和shRNA-4-LV不同病毒感染靶细胞后获得的cDNA为模板，进行实时定量扩增，RT-qPCR反应为10 μL体系。体系为2×SYBR Green Ⅰ Master 5.0 μL；NYDSP27/GAPDH-qPCR-F 0.2 μL；NYDSP27/GAPDH-qPCR-R 0.2 μL；cDNA 1.0 μL；ddH2O 3.6 μL。荧光定量PCR反应程序为95℃ 5 min，95℃ 15 s，59℃ 30 s，40个循环。采用统计学软件软件进行统计学分析，平均值±标准差来表示实验数据，计算NYD-SP27 mRNA 的相对表达水平公式为：

根据Lip2000转染试剂说明书将pLL3.7-NC-shRNA、pLL3.7-NYDSP27-shRNA-1、pLL3.7-NYDSP27-shRNA-2、pLL3.7-NYDSP27-shRNA-3 和pLL3.7-NYDSP27-shRNA-4及辅助质粒(VSVG、pMDL和REV)转染到HEK-293FT细胞48 h后，包装出shRNA-1-LV、shRNA-2-LV、shRNA-3-LV和shRNA-4-LV 种慢病毒，以及NC-LV阴性对照慢病毒、荧光倒置显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果发现，HEK-293FT细胞中有大量绿色荧光蛋白表达，重组慢病毒包装成功(图4)。

南北朝时期，目录学家王俭编撰的《七志》和阮孝绪编撰的《七录》，成为有重大影响的私人编撰的图书目录分类专著。其中，《七志》是我国第一部私人编撰的图书目录分类专著，首创了传录体的书目体例。

不同固液质量比制备样品技术指标见表3。表3数据显示，固液质量比越小，高溶氧化钼杂质含量和氨不溶钼含量越低，当固液质量比在1∶10～1∶15之间变化时，氨不溶钼分布在0.35%～0.26%之间，即氨不溶钼变化不大，固液质量比越小，设备单位效率越低，综合氨不溶钼和设备效率因素选择固液质量比为1∶10较合适。

1.2.1 靶向干扰片段的设计及合成 根据以现有的绵羊NYD-SP27基因的序列，用sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/life-science/custom-oligos/sirna-oligos .html)的设计软件和Clontech公司RNAi Target Sequence Selector软件(http://www.clontech.com/CN/Support/On line-Tools)设计靶向绵羊NYD-SP27基因的干扰片段及其1个阴性对照的干扰片段(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 结果

2.1 shRNA-pLL3.7 慢病毒干扰载体的构建

根据绵羊NYD-SP27(登录号：KX905090)基因序列，结合Clontech公司和Sigma公司在线设计RNAi软件设计和合成[生工生物工程(上海)股份有限公司]靶向NYD-SP27的4条干扰片段，根据合链的具体要求将2条链稀释至 50 μmol/L；按照具体方式合成双链，然后将5对双链连接至载体pLL3.7 上，经鉴定得到了靶向NYD-SP27干扰片段的慢病毒载体。琼脂糖凝胶电泳验证合链结果，电泳结构图表明各个干扰片段已合链成功，大小约为 60 bp，与实际结果相符(图1)。pLL3.7 慢病毒空载体，用HpaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，发现获得了处于7 000 bp～10 000 bp之间的特异性的条带(图2)，与实际载体大小一致。将合链后的片段与双酶切后的PLL3.7慢病毒载体连接、转化，挑取单克隆菌落去测序，将测序结果进行比对(图3)，证明连接成功。

M.DNA标准DL 500；1.NYDSP27-shRNA-1；2.NYDSP27-shRNA-2；3.NYDSP27-shRNA-3；4.NYDSP27-shRNA-4；5.NC-shRNA

M.DNA Marker DL 500；1.NYDSP27-shRNA-1；2.NYDSP27-shRNA-2；3.NYDSP27-shRNA-3；4.NYDSP27-shRNA-4；5.NC-shRNA

图1 琼脂糖凝胶电泳检测正、反义链合链结果

Fig.1 Detection of double-strand fusion by agarose gel electrophoresis

M.DNA标准DL 10 000；1～4 PLL3.7双酶切；5.PLL3.7质粒

M.DNA Marker DL 10 000；1-4.Digestion of PLL3.7 by double enzymes；5.plasmid PLL3.7

图2 PLL3.7双酶切鉴定

Fig.2 Identification of the plasmid PLL3.7 by double enzymes digestion

2.2 HEK-293FT 细胞包装重组慢病毒

2-△△CT=2-[(实验组目的基因CT值-实验组内参基因CT值)

2.3 慢病毒感染靶细胞

用浓缩后的慢病毒shRNA-1-LV、shRNA-2-LV、 shRNA-3-LV、shRNA-4-LV以及NC-LV分别感染BHK-SP27-21稳定转染细胞，为了增加感染效率加入聚凝胺，感染48 h后荧光显微镜下观察感染情况(图5)。

图3 序列比对分析鉴定重组慢病毒载体

Fig.3 Identification of the recombinant lentiviral plasmids with sequence analysis

2.4 实时荧光定量PCR筛选效率干扰片段

提取慢病毒感染靶细胞48 h后的RNA，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，以细胞中GAPDH为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测绵羊NYD-SP27基因的表达量，通过对图6的分析可知之前设计的实时荧光定量引物较好，通过对实时定量结果的数据分析，按照相关公式计算，最终结果表明shRNA-1-LV病毒感染细胞后干扰效果最好，干扰效率可达到74%，与对照组有极显著差异(表2)。表明NYDSP27-shRNA-1干扰片段能显著的抑制绵羊NYD-SP27基因的表达(图7)。

将手术病理检查结果作为金标准,计算出感兴趣区域小于病灶大小两倍以及感兴趣区域大于等于病灶大小两倍时,乳腺恶性病变的检查准确性、误诊率。

降雨前后土质边坡非饱和-饱和渗流场的计算结果如由图5所示。从图5(a)中可以看出，雨水入渗前，土质边坡的地下水位线即为孔隙水压力0值线；地下水位线以上的土体处于非饱和状态，孔隙水压力为负值，按逆向静水压力梯度分布；地下水位线以下的土体处于饱和状态，孔隙水压力为正值，按正向静水压力梯度分布。随着雨水入渗，从图5(b)—图5(e)中可以发现，相对于雨水入渗前的非饱和状态下的存在明显不同，土质边坡表层土体由非饱和转变为饱和，土体中的孔隙水压力由无雨水入渗前的负值变为按照静水压力分布的正值，土体中的基质吸力减小。并且随着降雨时间的增加，逐渐向边坡内部扩散，湿润锋面上的负孔隙水压力按梯度重新分布。

A.包装成功的重组慢病毒shRNA-1-LV；B.包装成功的重组慢病毒shRNA-2-LV；C.包装成功的重组慢病毒shRNA-3-LV ；D.包装成功的重组慢病毒shRNA-1-LV；E.阴性对照慢病毒

A.Packaged recombinant lentivirus shRNA-1-LV；B.Packaged recombinant lentivirus shRNA-2-LV；C.Packaged recombinant lentivirus shRNA-3-LV；D.Packaged recombinant lentivirus shRNA-1-LV；E.Negative control lentivirus

图4 慢病毒包装时绿色荧光蛋白表达情况

Fig.4 EGFP expression during lentivirus generation

A.shRNA-1-LV 感染BHK-SP27-21细胞；B.shRNA-2-LV 感染 BHK-SP27-21细胞；C.shRNA-3-LV 感染 BHK-SP27-21细胞；D.shRNA-4-LV感染 BHK-SP27-21细胞；E.NC-LV 感染 BHK-SP27-21细胞

A.shRNA-1-LV infected BHK-SP27-21 cells；B.shRNA-2-LV infected BHK-SP27-21 cells；C.shRNA-3-LV infected BHK-SP27-21 cells；D.shRNA-4-LV infected BHK-SP27-21 cells；E.NC-LV infected BHK-SP27-21 cells

图5 重组慢病毒感染BHK-SP27-21细胞

Fig.5 BHK-SP27-21 cells infected with recombinant lentivirus

3 讨论

NYD-SP27基因属于PLCζ家族，通过长期以来研究有关人类和高效小鼠NYD-SP27蛋白的研究表明，NYD-SP27与PLCζ基因序列高度同源。Aarabi M通过免疫印迹法研究分析PLCζ的表达，在睾丸组织中发现比 PLCζ蛋白条带稍小的条带(约55 ku～65 ku)，它们经常被认为是降解产物，无关交叉反应的蛋白质[10]或剪接变体[11]。NYD-SP27主要是作为PLC的抑制剂存在，在PLCζ蛋白获能之后逐渐丢失，起到能够维持获能和顶体反应前精子顶体膜的完整性和稳定性的功能，机理尚不清楚，不过这种行为对受精具有重大的意义。

A,a.GAPDH熔解曲线和扩增曲线; B,b.绵羊NYD-SP27熔解曲线和扩增曲线 A,a.The amplification curve and solubility curve of GAPDH; B,b.The amplification curve and solubility curve of ovine NYD-SP27

图6 GAPDH基因和绵羊NYD-SP27基因荧光定量扩增曲线和熔解曲线

Fig.6 The amplification curves and solubility curves of ovine NYD-SP27 and GAPDH

表2 慢病毒感染后NYD-SP27的mRNA相对水平

Table 2 NYD-SP27 mRNA relative levels post-infection

项目ItemNYD-SP27 mRNA相对水平Relative levels of NYD-SP27 mRNA干扰效率/%Interference efficiencyshRNA-1-LV0.26±0.01B74shRNA-2-LV0.50±0.03b50shRNA-3-LV0.65±0.02b35shRNA-4-LV0.86±0.04b14ShRNA-NC1.01±0.01a0

注：同列数据后标不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

Note:In the same column,data with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01),and with different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

相对于非病毒载体而言，病毒载体具有一定优势[12]，同样在这些病毒载体当中，发现最安全有效的载体是不可复制的慢病毒载体(逆转录病毒类)[13]；慢病毒载体的优势主要体现在能够和宿主细胞基因组进行整合，从而使目的基因能够在细胞中稳定表达[14-16]。

本研究主要是通过设计好的shRNA短片段分别连接至pLL3.7中，进一步包装和感染靶细胞，促使shRNA能够在靶细胞内长时间、稳定的生成，进而起到能够抑制NYD-SP27的表达的结果。为了对慢病毒感染细胞的效率方便监测，将pLL3.7载体敲除shRNA表达框外进行绿色荧光蛋白的报告基因表达框的替换，同时也起到对RNA干扰的效果进行预测的作用。荧光显微镜下绿色荧光蛋白表达量统计和实时荧光定量检测结果相一致，鉴定出NYDSP27-shRNA-1是扰效率较高的片段。因此，NYDSP27-shRNA-1可以作为干扰NYD-SP27基因表达的载体，为研究该基因在下调水平时对精子的发生和获能的影响提供了行之有效的工具。

所谓真实是指细节描写能够精确而又惟妙惟肖地反映现实生活中的人事特征。而典型是指描写的细节具有广泛的代表性，能够通过个别的、细小的事物反映人物事物的一般与全貌，由现象揭示本质。

X轴.各种重组载体；Y轴.慢病毒感染后NYD-SP27的mRNA 相对水平

X axis.recombinant vectors; Y axis.NYD-SP27 mRNA levels relative to GAPDH

图7 慢病毒感染后NYD-SP27的mRNA相对水平

Fig.7 NYD-SP27 mRNA relative levels post-infection

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