从20世纪30年代人们发现多糖的抗肿瘤活性后，科研工作者对中药多糖产生了浓厚的兴趣，发现了多种具有生物活性的中药多糖。免疫调节作用是中药多糖的生物活性之一，大量的药理试验也证实中药多糖能通过激活淋巴细胞，使淋巴细胞处于活化状态，诱导细胞形态、功能和表型发生变化，分泌细胞因子等方式增强机体免疫力。并且，中药多糖具有疗效持久，毒性和不良反应少等诸多优点[1]。

主要组织相容性复合体(majior histocompatibility complex，MHC)是与免疫应答和抗病性密切相关的一组基因群，它编码细胞表面的特异性蛋白。MHC作为细胞表面的糖蛋白，在细胞免疫和体液免疫中发挥着重要作用。MHC抗原基因具有高度的多态性，不仅决定了所表达抗原分子的多态性，而且决定了生物学功能的多样性。由于MHC基因的多态性导致不同个体间对疾病抗性和易感性存在差异[2-3]。王世波等[4]研究了鲁禽鸡、琅琊鸡和石歧鸡B-F exon2的多态性以及SNP位点与绵羊红细胞(SRBC)免疫抗体滴度和新城疫(ND)及禽流感(AI)的免疫抗体滴度的相关性，发现AI、ND以及SRBC抗原抗体的产生与B-F exon2的多态性有较强的相关性。周伟等[5]研究了狼山鸡MHC多态性及血型与部分抗性性状相关性，结果提示免疫性状和血型之间有关联性。

基于以上研究基础，本试验采用PCR-SSCP和实时荧光定量PCR real-time PCR方法，检测中药复方多糖(compound Chinese herbal medicinal polysaccharides，cCHMPS)对不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型鸡淋巴细胞中IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达量的影响，探讨MHC B-Lβ Ⅱ基因多态性对中药复方多糖提高鸡淋巴细胞中细胞因子mRNA表达量的最佳使用剂量的影响。

友好城市机制在南方丝绸之路旅游带建设中的困境与对策…………………………………………………赵建军（117）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 中药复方多糖由党参、山楂、熟地、何首乌、当归、茯苓、补骨脂等11味中药组成，各单味药均购自石河子市医药公司；中药复方多糖粗提取物是从中药复方中采用水提-醇沉法提取，再经AB-8大孔吸附树脂吸附解吸附后获得精制的中药复方多糖，即cCHMPS，其含糖量为77.10%；用不含血清的RPMI-1640培养液将其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，经0.22 μm微孔滤膜滤过后4℃储存备用。

对所有DNA样本的PCR产物进行SSCP多态性检测，发现所扩增片段有3种基因型，分别定义为AA(103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(图2)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 500羽1日龄京红1号蛋鸡，购自新疆昌吉某孵化场。翅下静脉采血0.2 mL/羽，置于肝素钠抗凝采血管中摇匀，置-20℃冷冻保存。按照DNA提取试剂盒说明书提取鸡全血DNA，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计 根据GenBank中收录的鸡MHC B-LβⅡ基因序列(№M29763.1)，应用Oligo软件设计引物，引物序列为：上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，扩增片段238 bp，引物由华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增 PCR扩增体系为20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上、下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O，总体积为20 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 40 s，60.5℃ 45 s，72℃ 35 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃结束反应。取5 mL PCR扩增产物由20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并拍照。

1.2.4 淋巴细胞的分离与成活率检测 根据PCR-SSCP基因型对鸡分组，参照文献[6]静脉采血提取淋巴细胞，胎盘蓝染色，显微镜下数死细胞和活细胞个数，计算活细胞成活率。

1.2.5 试验分组与细胞培养 将分离得到的淋巴细胞浓度调整为5×106 个/mL。将鸡淋巴细胞按不同基因型分组，每组设置3个剂量组，调整cCHMPS的终浓度分别为100、75、50、0 μg/mL，接于6孔培养板中，37℃、体积分数为5% CO2恒温培养箱中培养24 h后收集细胞。

1.2.6 鸡淋巴细胞总RNA提取 收集淋巴细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取淋巴细胞的总RNA。RNA纯度检测：检测其OD260nm/OD280nm比值，其比值在1.8～2.0之间。

用所设计的鸡IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因的引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，经 20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得了145 bp、80 bp、229 bp的目的条带(图3)。

2．入库文献的选择必须遵循完整性原则。不采用传统语料库建设中随机择句或择段的方式选择语料，不论文献长短都进行全文收录，确保古籍文献的全貌；不要求语料库规模和入库语料追求“大而全”，反对不加选择地简单堆砌罗列所有文献。

由表2可知，与对照组相比，cCHMPS能显著促进鸡淋巴细胞IL-1β mRNA的表达，且在不同基因型鸡中，最有效的提高IL-1β mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，cCHMPS剂量为75 μg/mL和50 μg/mL时，鸡淋巴细胞IL-1β mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，cCHMPS剂量为100 μg/mL时，鸡淋巴细胞IL-1β mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，cCHMPS剂量为50 μg/mL时，IL-1β mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。

表1 目的基因引物序列及PCR条件

Table 1 Primer sequences of target genes and PCR conditions

目的基因Target gene登录号GenBank №产物/bpProduct引物序列(5'→3)Sequence of primer(5'→3)退火温度/℃Annealing temperatureIL-1βHQ329098.1145 F:TCTTCTACCGCCTGGACACGR:TAGGTGGCGATGTTGACCTG58IL-8HM-179639.180 F:CATCATGAAGCATTCCATCTR:CTTCCAAGGGATCTTCATTT54TNF-αNM-204267229 F:TGTGTATGTGCAGCAACCCGTAGTR:GGCATTGCAATTTGGACAGAAGT60β-ActinNM-205518.1100 F:ACCGCAAATGCTTCTAAACCR:ATAAAGCCATGCCAATCTCG59

cDNA的PCR反应体系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O，10 μL的2×RCRMix， 总体积为20 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃结束反应。

1.2.9 实时荧光定量PCR real-time PCR反应体系：2×TransStart® Tip Green qPCR SuperMIX 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，20 μL体系。反应程序为：94℃ 30 s；94℃ 5 s；退火15 s，72℃ 10 s，共42个循环。

2017年年底，大医二院获评支付宝“未来医院服务创新示范单位”，此榜单全国仅有16名在列。孙岩国援引资料表述：2015年4月29日，大医二院支付宝服务窗上线后，迅速得到年轻人热捧，22万注册用户中，年轻人近九成，日均访问量5000余笔，移动支付日均超过2000笔，交易笔数在全国排名第六，挂号、就诊、取报告、缴费等可以不再排队，一部智能手机就能完成。

1.3 数据分析

用2-△△Ct法计算目的基因IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA的相对表达量。所有数据以均数±标准差表示。用SPSS 17.0软件分析，计量资料采用t检验，所有统计分析结果以P<0.05作为差异显著性的判断标准，并且将对照组的mRNA的相对表达量设置为1。

2 结果

2.1 MHC B-LβⅡ基因PCR扩增结果

由表3可知，与对照组相比，cCHMPS能显著促进鸡淋巴细胞TNF-α mRNA的表达，且在不同基因型鸡中，最有效的提高TNF-α mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，cCHMPS剂量为75μg/mL和50 μg/mL时，鸡淋巴细胞TNF-α mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，cCHMPS剂量为100 μg/mL时鸡淋巴细胞TNF-α mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，cCHMPS剂量为50 μg/mL时，TNF-α mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。

1.2.7 RNA反转录 将2 μL 5×gDNA Graser buffer、1 μL gDNA eraser、5 μL RNase free water、2 μL RNA模板混匀，42℃反应2 min，迅速冰浴，即反应液Ⅰ，最后将1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase free water加入反应液Ⅰ中，37℃反应15 min，85℃加热5 s使反转录酶失活，取出EP管，置-20℃贮存备用。

1.DNA 标准DL 1 000； 2～11.MHC B-LβⅡ基因 1.DNA Maker DL 1 000；2-11.MHC B-LβⅡ gene

图1 MHC B-LβⅡ基因PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification results of MHC B-LβⅡ gene

2.2 PCR-SSCP分析

1.1.2 试剂与仪器 鸡外周血淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；RPMI 1640培养基，PBS磷酸缓冲液，胎牛血清，SYBR Green荧光染料，real-time PCR试剂，全式金公司产品；DEPC，上海生物工程公司产品；鸡新城疫疫苗(La Sota株)，普莱柯生物工程股份有限公司产品；RNA、DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it，北京田根生物工程公司产品；高速冷冻离心机，垂直离心机，新疆农垦科学院实验室。

通过完善现代化的出租车市场，规范运营的模式，从而促进出租车行业的良性发展。并且出租车行业可以大胆进行创新经营模式，改变原有的挂靠模式和合作经营模式，采用股份制或员工制，将公司利益和个人相结合；可以通过一定的激励措施，发挥企业的主体作用，合理分配盈利，并进行企业和出租车业主双方的有效沟通，从而建立良好的劳动关系，实现互赢互利的模式。

(2)对接BEPS第6项行动计划成果，完善国内法中防止税收协定滥用规定。2014年12月2日，国家税务总局颁布了《一般反避税管理办法(试行)》，引入BEPS第6项行动计划成果《防止税收协定优惠的不当授予》的相关建议，对税收协定滥用加以规制。

1、6、8、10、12.BC基因型；3、5.AA基因型；2、4、7、9、11、13.BB基因型

1，6，8，10，12.BC genotype; 3，5.AA genotype; 2，4，7，9，11，13.BB genotype

图2 部分鸡 MHC B-Lβ Ⅱ基因PCR-SSCP电泳图谱

Fig.2 Electrophoretic patterns of PCR-SSCP products of MHC B-LβⅡ gene

2.3 IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin扩增结果

（1）灵活地运用“套路”，化繁为简。对于同一类型的数学题目，洞察其中的普遍规律，归纳出特定的解题方法，达到“一通百通”的效果。我们往往可以套用一些特定的答题模板，而熟悉这种套路可以帮助我们快速地切入考题要点，并高效完成解题过程。例如我们可以将对数平均不等式应用在绝大多数的“函数零点关系”问题中。

1.IL-1β基因; 2.IL-8基因; 3.TNF-α基因; 4.基因β-Actin; 5.DNA 标准

1.IL-1β gene; 2.IL-8 gene;3.TNF-α gene; 4.β-Actin gene; 5.DNA Maker

图3 IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因PCR产物电泳图

Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR products of IL-1β,TNF-α,IL-8 and β-Actin genes

2.4 中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡外周血淋巴细胞中IL-1β mRNA表达量的影响

1.2.8 cDNA的PCR反应体系与程序 根据GenBank公布的IL-1β、TNF-α、IL-8及β-Actin基因mRNA的全长序列设计RCR特异性引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

2.5 中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡外周血淋巴细胞中TNF-α mRNA表达量的影响

用所设计的引物对基因组DNA进行扩增，取所得PCR产物5 μL于琼脂糖凝胶上进行电泳(图1)。所设计引物的扩增结果较好，片段长度与预期大小一致，条带清晰，无非特异性条带，可直接进行SSCP分析。

方：您从事图书馆工作、专业教学以及科学研究几十年，在这过程中您肯定有太多太多的感悟，其中最深的体会是什么？

2.6 中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型鸡外周血淋巴细胞中IL-8 mRNA表达量的影响

由表4可知，与对照组相比，cCHMPS能显著促进鸡淋巴细胞IL-8 mRNA的表达，且在不同基因型鸡中，最有效的提高IL-8 mRNA表达量所需的cCHMPS剂量不同。AA基因型鸡中，cCHMPS剂量为75μg/mL和50 μg/mL时，鸡淋巴细胞IL-8 mRNA表达量显著高于其他剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，cCHMPS剂量为100 μg/mL时鸡淋巴细胞IL-8 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，cCHMPS剂量为50 μg/mL时，IL-8 mRNA表达量均显著高于其他剂量组(P<0.05)。

表2 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞IL-1β mRNA表达量的影响

Table 2 Effect of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides on IL-1β mRNA expression levels in different genotype chickens

基因型Genotype不同剂量的中药复方多糖/(μg·mL-1)Different doses of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides05075100AA基因型 AA genotype11.90±0.01a*1.89±0.03a*1.63±0.02b*BB基因型 BB genotype11.70±0.03a*1.71±0.02a*2.02±0.06b*BC基因型 BC genotype11.98±0.06a*1.82±0.03b*1.79±0.04b*

注：同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，*表示与对照组比较差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

表3 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞TNF-α mRNA表达量的影响

Table 3 Effect of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides on TNF-α mRNA expression levels in different genotype chickens

基因型Genotype不同剂量的中药复方多糖/(μg·mL-1)Different doses of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides05075100AA基因型 AA genotype12.01±0.03a*2.00±0.05a*1.91±0.02b*BB基因型 BB genotype11.89±0.02a*1.90±0.02a*2.27±0.06b*BC基因型 BC genotype12.16±0.05a*1.72±0.02b*1.71±0.03b*

注：同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，*表示与对照组比较差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

表4 中药复方多糖对各基因型鸡淋巴细胞IL-8 mRNA表达量的影响

Table 4 Effect of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides on IL-8 mRNA expression levels in different genotype chickens

基因型Genotype不同剂量的中药复方多糖/(μg·mL-1)Different doses of compound Chinese herbal medicinal polysaccharides 05075100AA基因型 AA genotype11.37±0.04a*1.39±0.06a*1.28±0.02b*BB基因型 BB genotype11.31±0.03a*1.31±0.01a*1.40±0.03b*BC基因型 BC genotype11.38±0.04a*1.29±0.04b*1.30±0.05b*

注：同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，*表示与对照组比较差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,different letters mean significant difference(P<0.05).*means significant difference compared with control group.

3 讨论

3.1 中药复方多糖对鸡淋巴细胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表达量的影响

淋巴细胞是参与机体免疫应答的主要免疫效应细胞[7]。淋巴细胞分泌的细胞因子是一类具有免疫调节功能的蛋白质类物质，是免疫系统重要的免疫信号分子[8]。研究细胞因子有助于了解机体的免疫调节机制。IL-1β、TNF-α、IL-8等炎症细胞因子在免疫应答中充当着十分重要的角色。其中，IL-1β是IL-1的主要亚型之一，具有高度生物活性，可以诱导淋巴细胞的增殖分化，刺激抗体产生，调节免疫作用等[9]，也能刺激产生IL-8、中性粒细胞活化剂等多种趋化因子，以及诱导单核细胞和巨噬细胞释放IL-6、TNF[10]。IL-8是一种趋化性细胞因子，由Th1细胞分泌的细胞因子，使趋化细胞到达炎症部位，激活炎性细胞，诱导细胞增殖，释放炎性介质，具有抗炎的作用[11]。TNF-α是由Th1细胞分泌，它作为活化的单核细胞产生的一种具有多种生物学功能的细胞因子在炎症和感染机制中起着介导作用[12]。TNF-α可杀伤肿瘤细胞，激活中性粒细胞，促进淋巴细胞的分化和增殖，同时可促进淋巴细胞分泌的IL-1β及TNF-α等细胞因子[13]。

许多研究表明，中药多糖对机体的细胞因子都具有调节作用。赵天章等[14]研究了黄芪多糖(APS)对肉仔鸡血清免疫细胞因子含量的影响，发现APS可提高肉仔鸡血清IL-1、IL-2、TNF-α的含量。伊瑞卿等[15]研究了枸杞多糖对肉仔鸡生产性能和免疫功能的调节作用，结果显示枸杞多糖能提高鸡淋巴细胞IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表达量。孟俊龙等[16]研究表明，姬松茸多糖可提高大鼠脾脏IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等细胞因子mRNA的表达。李馨等[17]研究表明，北冬虫夏草多糖可以增加脾脏IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表达量，增强机体免疫力。江泽波等[18]研究表明，猪苓多糖可通过TLR4信号通路活化M1巨噬细胞，上调IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量，从而起到增强机体免疫力的效应。本研究表明，中药复方多糖能提高IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA的表达量，提示中药多糖可能通过诱导细胞因子的产生，增强机体的抗感染能力。当然，中药多糖虽然能促进机体IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达，但是并非越高越好，三者之间必须处于一定的平衡状态，才能维持机体正常的生命活动，否则会发生自身免疫疾病等严重症状。

3.2 鸡MHC B-LβⅡ基因多态性对cCHMPS促进淋巴细胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表达量的剂量影响

鸡MHC基因家族在机体内发挥着极其重要和十分广泛的生物学功能，同时鸡MHC抗原在体液免疫和细胞免疫中均有重要作用。鸡MHC抗原在体液免疫和细胞免疫发挥着很重要的作用。每个个体细胞表面的MHC抗原都具有特异性，是自身识别的标志，能强烈排斥外来异物。T细胞表面有抗原结合的受体，简称TCR(T cell receptor)。TCR具有特异性，只与特定的抗原结合， TCR只识别结合在自身MHC分子上的抗原。大多数T细胞含有CD4和CD8膜分子，表达的CD4 T细胞只识别MHC Ⅱ类分子递呈的抗原。CD4 T细胞做为辅助性T细胞(Th)，通过识别抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)MHCⅡ类分子递呈的抗原而被活化，活化后的Th细胞分裂增殖，同时分泌各种细胞因子，参与调节免疫应答。此外，T细胞在识别外来抗原同时，还要识别MHC分子，说明T细胞受体在识别抗原时需要依赖抗原递呈的MHC分子[3]。

鸡MHC B-Lβ Ⅱ基因具有丰富的多态性和功能特异性，是人们研究抗病基因的主要候选基因之一。李福伟等[19]研究表明个体以及品种之间存在不同免疫能力的遗传差异，并且不同的免疫性状存在显著的优势基因型。李尚民[20]等的研究表明鸡MHC B-Lβ Ⅱ基因外显子2的遗传变异对京海黄鸡抗病能力影响显著，可作为球虫抗病能力选育候选基因。刘立波[21]等研究了鸡MHC B-L基因SNPs单倍体型与血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗体滴度等免疫性状关系，结果表明不同免疫性状存在显著相关的优势SNPs单倍型。杨红洋等[22]研究了中药复方多糖对不同MHC B-Lβ Ⅱ基因型鸡血清细胞因子质量浓度的影响，发现MHC B-Lβ Ⅱ基因多态性使鸡血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α质量浓度产生差异。本次试验发现，在同一剂量的cCHMPS中，不同MHC B-L β Ⅱ基因型鸡，其淋巴细胞中IL-1β、IL-8、TNF-α mRNA表达量差异显著，此研究结果与李福伟、李尚民、刘立波、杨红洋等人的究结果相一致，说明不同免疫能力存在个体水平上的差异，并且在不同基因型鸡中，最有效的提高鸡淋巴细胞的细胞因子mRNA表达量的cCHMPS剂量略有不同。

从本试验得出中药复方多糖可以通过促进细胞因子的分泌来提高机体免疫力且其生物活性有一定的剂量范围，同时MHC B-Lβ Ⅱ基因多态性使不同个体鸡的免疫能力产生差异。

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