鱼腥党参散是按照传统中兽医理论，从《饲料目录》中选取鱼腥草、党参等可饲用天然植物，组成的一个可饲用天然植物组方，具有益气扶正、清热解毒、通经散淤的功效。前期研究已表明鱼腥党参散可以显著降低奶牛乳中体细胞数，提示其具有抑制奶牛乳房炎的作用。为了进一步阐明鱼腥党参散的抗炎机制，本文通过LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型，通过测定鱼腥党参散对细胞因子及NF-κB信号通路的影响，初步阐明其抗炎作用机理，以期为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 RAW264.7小鼠巨噬细胞瘤细胞，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.1.2 药品和试剂 鱼腥党参散由鱼腥草、党参等药物组成，石家庄九鼎动物药业公司提供；LPS(批号121M4024V)，MTT，Sigma公司产品；DMEM(高糖)，DMSO，北京索莱宝公司产品；胎牛血清，杭州四季青公司产品；Griess法NO检测试剂盒，Promega公司产品；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10非即用型ELISA检测试剂盒，R&D公司产品；蛋白浓度检测试剂，Thermo公司产品；一抗，CST公司产品；二抗，康为世纪公司产品；显色液，百智生物科技有限公司产品；BSA,Biotopped公司产品。

1.1.3 仪器设备 SYNERGY HTX全波长酶标仪，BioTek公司产品；Series II Water Jacket二氧化碳培养箱，Thermo公司产品；CKX41光学显微镜，Olympus公司产品；电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司产品；转膜仪,Bio-Rad公司产品。

构件设计主要是应用了草图设计和线框建模等功能，以此进行工程结构的三维构件设计。其中，构件装配主要是指对于设计好的构件模型，要装配成一个工程结构模型，从而促进装配工作的顺利完成，而结构配筋主要是指在设计好的构件上进行配筋工作，这与以往配筋图纸存在极大的区别。在该模块中，对全三维的钢筋配置进行了广泛应用，设计人员在施工之前，可以充分了解施工时的真实效果。此外，地质建模主要是指通过钻探和物探等方式获取的勘察资料，借助三维建模技术，及时构造出三维地质模型。

1.2 方法

1.2.3.1 鱼腥党参散对RAW264.7细胞分泌NO的影响 取处于对数生长期的 RAW264.7细胞，接种于6孔培养板，细胞密度约为5×105个/mL，每孔2 mL细胞混悬液，37℃、体积分数为5% CO2条件下培养12 h。吸弃全部培养液，针对不同组别加入含不同成分的DMEM(高糖)培养液2 mL，具体为：对照组及LPS组，加入DMEM(高糖)培养液；用药组，在DMEM(高糖)培养液中加入浓度为1 g/mL的鱼腥党参散母液，0.22 μm过滤后稀释，鱼腥党参散组终浓度分别为5、2.5、1.25 mg/mL，下同，每组3个复孔，培养4 h。预处理后吸弃全部培养液，对照组加入DMEM(高糖)培养液；LPS组及各用药组加入含LPS(终浓度为1 μg/mL)的DMEM(高糖)培养液，培养24 h。收集细胞培养上清液，使用Griess法试剂盒测定各组样品的NO含量。

浓度≤6 mg/mL的鱼腥党参散在24 h内对RAW264.7细胞无毒性作用，OD值与对照组无差异(P>0.05)。后续试验中的药物剂量均在安全范围内选取(图1)。

1.2.5 数据分析 试验数据录入SPSS19.0软件进行分析，结果以平均数±标准差表示。各组求平均值后，两两对比，进行单因素方差分析 。

1.2.1 鱼腥党参散的制备 将原药首次加500 mL蒸馏水浸泡1 h，文火煎煮40 min，第2次加8倍量蒸馏水，文火煎煮30 min，第3次加6倍量蒸馏水，文火煎煮20 min，每次煎煮完后用8层纱布过滤，浓缩至 1 g生药/mL，过滤灭菌，4℃保存。

分析相关数据，发现患者院内感染发生率与患者年龄、吸烟史、基础营养状况、使用糖皮质激素、是否合并糖尿病、临床分期、有恶侵袭性操作、放疗化疗、手术、患者住院时间等因素有关，差异具有统计学意义(P<0.05)。分析结果见表3。

1.2.3.2 鱼腥党参散对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的影响 细胞处理同1.2.2。于培养达24 h时，收集细胞培养上清液，使用ELISA检测试剂盒测定各组样品的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量。

LPS组细胞在致炎药物刺激24 h后，其NO分泌量极显著高于对照组(P<0.01)。细胞经4 h不同浓度的药物保护后再经LPS刺激24 h，鱼腥党参散各剂量组的NO分泌量均极显著低于LPS组(P<0.01)，并且呈现剂量依赖关系，即在用药安全范围内，药物浓度越高抑制NO分泌的效果越好(图2)。

1.2.4 鱼腥党参散对RAW264.7细胞p65和IκB以及P-p65和P-IκB蛋白表达量的影响 细胞处理同1.2.2。培养达24 h时，提取细胞总蛋白并定量后电印迹转移法转膜，50 g/L BSA(牛血清白蛋白)封闭液摇床封闭过夜，摇床孵育一抗(稀释度1∶1 000)2 h，TBST洗膜3次，AP标记的二抗(稀释度1∶2 000)，摇床孵育2 h，TBST洗膜3次,在暗室中使用BCIP/NBT试剂显色，进行数据分析。

通过空间结构分析软件Winkelmass计算林木结构参数大小比数、角尺度和混交度。将缓冲区大小设置为5 m，以避免边缘效应对分析结果的影响，同时可以有更多的调查数据参与应用。

1.2.3 鱼腥党参散对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响

本文基于我校人力资源管理专业现有软硬件资源设计的综合实践技能竞赛，面向员工招聘、培训与开发、绩效考评、薪酬设计、劳动关系管理等多个职能模块。通过项目整体研究致力于实现技能竞赛涵盖知识全面化、培养学生趣味化、提高技能显著化的目的。

2 结果

2.1 鱼腥党参散对细胞活性的影响

1.2.2 鱼腥党参散对RAW264.7细胞的毒性作用 取处于对数生长期的RAW264.7细胞，接种于96孔培养板，细胞密度约为5×105个/mL，每孔100 μL细胞混悬液，37℃、体积分数为5% CO2条件下培养12 h，待其贴壁且恢复至静息状态。吸弃全部培养液。针对不同组别加入含不同成分的DMEM(高糖)培养液各100 μL，具体为：对照组，加入DMEM(高糖)培养液；LPS组，LPS终浓度为1 μg/mL的DMEM(高糖)培养液；鱼腥党参散组，在DMEM(高糖)培养液中加入浓度为1g/mL的鱼腥党参散母液，0.22 μm过滤后稀释，鱼腥党参散组终浓度分别为8、7、6、5、4、3 mg/mL，每组6个复孔，继续培养24 h。各组均加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养2 h。终止培养，吸弃全部液体，各组均加入100 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪520 nm波长处测定各孔OD值。

**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01) ** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01)

图1 鱼腥党参散对RAW264.7的细胞毒性作用

Fig.1 The toxic effect of YuxingDangshen-San on RAW264.7 cells

2.2 鱼腥党参散对RAW264.7分泌NO的影响

在听觉上，民族唱法的音色亮多暗少，而美声的音色则相对较暗。在声音位置上，两种唱法也有不同之处，民族唱法高音转为脑后音，不竖上头顶，而美声唱法要求高音必须竖在头顶。

2.3 鱼腥党参散对RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的影响

LPS组细胞在致炎药物刺激24 h后，其TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10分泌量极显著高于对照组(P<0.01)。细胞经4 h不同浓度的药物保护后再经LPS刺激24 h，鱼腥党参散各剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的分泌量均极显著低于LPS组(P<0.01)，并且呈现剂量依赖关系，即在用药安全范围内，药物浓度越高抑制TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10分泌的效果越好(图3)。

2.4 鱼腥党参散对RAW264.7细胞p65和IκB以及P-p65和P-IκB蛋白表达量的影响

LPS组细胞在致炎药物刺激24 h后，其P-p65和P-IκB蛋白表达量明显增加，极显著高于对照组(P<0.01)。细胞经4 h不同浓度的药物保护后再经LPS刺激24 h，鱼腥党参散各剂量组的P-p65和P-IκB蛋白表达量均极显著低于LPS组(P<0.01)(图4)。各药物组均能够极显著降低p65和IκB蛋白的磷酸化水平，p65和IκB蛋白的表达量极显著升高(P<0.01)(图5)。

**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)；##表示与LPS组相比差异极显著(P<0.01)

** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01); ## indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01)

图2 鱼腥党参散对RAW264.7分泌NO的影响

Fig.2 Effects of YuxingDangshen-San on NO secretion in RAW264.7

**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)；##表示与LPS组相比差异极显著(P<0.01)

** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01); ## indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01)

图3 鱼腥党参散对RAW264.7分泌TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的影响

Fig.3 Effects of YuxingDangshen-San on TNF-α、IL-1β、IL-6 and IL-10 secretions in RAW264.7

图4 鱼腥党参散对P-p65和P-IκB蛋白表达量的影响

Fig.4 Effects of YuxingDangshen-San on protein expression levels of P-p65 and P-IκB

**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)；##表示与LPS组相比差异极显著(P<0.01)

** indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01); ## indicates extremely significant difference compared with LPS group (P<0.01)

图5 鱼腥党参散对p65和IκB蛋白表达量的影响

Fig.5 Effects of YuxingDangshen-San on protein expression levels of p65 and IκB

3 讨论

炎症反应是临床常见的病理过程，是指动物机体针对促炎因子、致炎因素、外界对机体的刺激发生的以防御反应为主的应答反应，以局部组织的变质、渗出和增生变化为主要表现[1]。巨噬细胞具有调节免疫应答、组织再生、影响造血和清除衰老细胞等多种生理功能。正常情况下，巨噬细胞不表现其免疫功能，但当受到脂多糖(LPS)、微生物、γ干扰素等外界刺激时，会被激活，产生并释放大量的NO、IL-6、TNF-α及IL-1β等炎症介质参与机体急性炎症应答，引起炎症损伤[2-3]。因此，LPS诱导的RAW264.7细胞是研究炎症机制的很好的炎症细胞模型[4]。

在免疫性炎症发病进程中，体内NO水平升高可从多个途径影响病理进程[5-6]，如NO在高浓度状态下，激活NF-κB，诱导促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等的产生，IL-1和TNF-α的产生又能激活iNOS，促进机体产生更多的NO，从而形成正反馈循环，使细胞因子的分泌以及其NO自身的表达得以持续，使炎症反应更持久，更剧烈[7]。NF-κB是一种具有多向性调节作用的蛋白质分子，它以p50/p65异源二聚体形式存在，广泛参与基因转录的调节与致炎性转录因子的表达，全身炎症反应中伴有多器官NF-κB的活化，介导多种炎症基因的表达[8]。正常情况下，NF-κB复合体在细胞内主要以p50/p65-IκB异源三聚体的形式存在于细胞浆中，在LPS作用于细胞后，NF-κB被活化，IκB被磷酸化，从而释放出NF-κB异源二聚体，使其进入细胞核内，磷酸化的p65蛋白在核内能够结合于DNA特定的κB位点，启动TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等多种细胞因子基因的转录和表达[9-11]。

有研究表明，鱼腥草可抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β、IL-8及丙二醛(MDA)的产生，从而发挥其抗炎、抗氧化作用[12]。鱼腥草以70℃蒸馏水浸泡5 h所得水提取物可抑制抗原诱导的IκB-α的降解和NF-κB的活化[13]。从党参中分离出的三帖皂苷，发现其有抗炎活性，可以通过靶向LPS/TLR4复合物来抑制脂多糖诱发的炎症，还可以通过抑制NF-κB的活性来改善TNBS诱导的结肠炎小鼠的症状[14]。这与本试验对鱼腥党参散的研究结果相似。

本试验中LPS诱导RAW264.7细胞24 h后，NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等的分泌量均极显著提高(P<0.01)，说明体外炎症模型的建立成功。试验中，经不同浓度鱼腥党参散保护4h后，能够极显著抑制RAW264.7细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6(P<0.01)，并且在一定浓度范围内呈现剂量依赖性。对于抑炎因子IL-10，本试验中未见其有显著升高，LPS诱导RAW264.7细胞24 h后，p65蛋白的磷酸化水平极显著升高(P<0.01)，提示更多具有活性的p65蛋白转移到细胞核内参与对相关基因的启动和调节。在LPS作用于RAW264.7细胞后，NF-κB信号通路被激活，IκB蛋白发生磷酸化后被降解，发挥相应的介导作用。LPS诱导RAW264.7细胞24 h后，能够极显著降低IκB和p65蛋白的表达量，经不同浓度鱼腥党参散保护4 h后，与LPS对照组进行比较，各药物组均能够极显著降低IκB和p65蛋白的磷酸化水平(P<0.01)，IκB和p65蛋白的表达量极显著升高(P<0.01)，说明鱼腥党参散可以通过阻断细胞内NF-κB信号通路的激活发挥其抗炎作用。鱼腥党参散对JAK-STAT和MAPK通路的影响还有待进一步的研究。

参考文献:

[1] Crume K P，Miller J H，La Flamme A C，et al.An antimitotic agent,specifically decreases tumor necrosis factor-a production by lipopolysaccharide-stimulated murine macrophages[J].Exp Biol Med，2007，232(5)：607-613.

[2] Park Y C，Lee C H，Kang H S，et al.Wortmannin，a specific inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase，enhances LPS-induced NO production from murine peritoneal macrophages[J].Biochem Biophys Res Commun，1997，240(3)：692-696.

[3] Nemeth E，Rivera S，Gabayan V，et al.IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hcpcidin[J].J Clin Invest，2004，113(9)：1271-1276.

[4] Hewett J A，Roth R A.Hepatic and extrahepatic pathobiology of bacterial lipopolysaccharides[J].Pharmacol Rev，1993，45(4):382-411.

[5] West N E，Qian H S，Guzik T J，et al.Nitric oxide synthase (nNOS) gene transfer modifies venous bypass graft remodeling：effects on vascular smooth muscle cell differentiation and superoxide production[J].Circulation，2001，104(13)：1526-1532.

[6] 杨 剑，牛晓艺，谭红连，等.“三黄连”合剂抗炎作用研究[J].动物医学进展，2015，36(6)：74-81.

[7] 范精华，刘 康，刘保林.NO在炎症及免疫应答中的调节作用[J].中外医疗，2009，28(25)：163-166.

[8] Lawrence T，Fong C.The resolution of inflammation:anti-inflammatory roles for NF-kappaB[J].Int J Biochem Cell B，2009，42(4)：519-523.

[9] Loo G V， Beyaert R.Negative regulation of NF-κB and its involvement in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther，2011，13(3)：221.

[10] Pernille Y， Mengel B.Modeling the NF-κB mediated inflammatory response predicts cytokine waves in tissue[J].BMC Syst Biol，2011，5(1)：1-9.

[11] Willam C.IKK-dependent,NF-κB-independent control of autophagic gene expression[J].Oncogene，2011，30(14)：1727-1732.

[12] 张美玉，李贻奎，闫位娟，等.鱼腥草注射液新制剂抗炎解热作用及其机制研究[J].中国新药杂志，2010，19(9)：775-779.

[13] Han E H，Park J H ，Kim J Y，et al.Houttuynia cordata water extract suppresses anaphylactic reaction and Ig E-mediated allergic response by inhibiting multiple steps of FcεRI signaling in mast cells[J].Food Chem Toxicol，2009，47(7)：1659-1666.

[14] Joh E H，Lee I A，Han S J.Lancemaside A ameliorates colitis by inhibiting NF-kappa B activation in TNBS-induced colitis mice[J].Int J Cogn Ergon，2010，25(5)：545-551.