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基于3D细胞水平的药物筛选模型

更新时间:2016-07-05

药物筛选是指利用适当的筛选方法和技术,建立合适的筛选模型,从可能作为药物使用的天然或合成化合物中得到高效的先导化合物,对其进行药理及药效活性的检测,评价某一化合物的药用前景的方法,是新药研发中缩短时间、减少成本和降低风险的关键步骤[1-2].虽然药物的吸收、分布和毒理等研究在过去20 年里有重大进展,但根据生物技术创新组织(BIO)2016年发布的报告显示,过去10 年间候选药物获得批准并投放市场的总体可能性仅为10%左右[3],如此高的淘汰率使作为新药研发源头的筛选工作成为医药行业一个重要的亟需突破的瓶颈[4-5].提高药物筛选的质量和降低费用在药物研发过程中至关重要[6].过去的半个世纪,药物筛选经历了从动物表型到分子再到细胞的过程.早期的整体动物筛选模型利用患病动物建模进行化合物的初筛、复筛和检验.通过表型直接观察目标化合物的作用情况,不但过程复杂、耗资巨大,而且存在病理部位和药物作用机制不明确等缺点.随着现代分子药理学研究的不断深入,研究者们发现功能蛋白质、生物活性成分在调节生命活动方面所起的重要作用,为药物筛选提供了新的方法和机会.以分子配基作为受体靶点的分子水平药物筛选模型逐渐成为使用范围最广、技术最成熟的筛选方法之一.该方法使药物的作用靶点清晰,但仍存在规模小、效率低等不足之处.基于传统筛选方法的缺陷,并随着细胞生物学和基因工程等学科的发展,细胞水平药物筛选逐渐成熟.以细胞作为筛选靶标,不仅可以考察药物的作用效果,明确作用靶点,还可以通过细胞的增值、衰亡以及胞内外环境的变化特征得到药物在体内的转运[7]、保留[8-9]和代谢[10]等动力学参数[11],具有微量、准确和稳定的特点,是目前使用较为成熟和广泛的一类方法.

传统的细胞筛选模型所利用的细胞通常是由病理部位细胞通过细胞培养等手段得到的单层细胞或单细胞的悬浮液,呈平面生长,缺乏细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的接触[12],细胞所处的环境与实体微环境截然不同.同氨基酸的盘曲折叠形成不同构象的蛋白质功能不同一样,细胞的堆积方式不同,它的特性也不尽相同,通过普通的平面2D细胞筛选得到的结果不能非常准确地反应药物在人体内的作用效果.例如,多年来癌症药物的发现主要是基于它对癌细胞的杀伤能力和精确抑制癌细胞基因的能力,这些化合物在使肿瘤部分或完全消退的同时,会伴随着大量的细胞毒性累积[13].而利用2D筛选模型得到的抗癌药物在杀灭病理细胞之后,积累的毒性可能会转而攻击周围的正常细胞.这使得大部分的抗癌药物后期都无法通过临床试验,浪费了大量的人力、物力与时间.所以,2D细胞筛选模型已经无法满足人们的需要.随着组织工程学的发展,人们致力于开发能更好地代表体内生物学的3D培养技术培养肿瘤、心脏和肝脏等模型[14-15],同时更趋向于大批量和小型化[3].3D细胞培养技术是将合适的载体与组织细胞在体外共培养,使细胞在特定的空间结构中生长、迁移和分化,形成组织特性,最大程度模拟组织生理作用及其周围内环境.下面介绍几种最常见的疾病的3D筛选模型.

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1 不同疾病的3D细胞筛选模型

1.1 肿瘤药物的3D细胞筛选模型

多细胞癌症肿瘤球模型(MCTS)是3D培养技术最典型的模型之一.根据形态学和基因表达的变化表明:MCTS是一个通过细胞之间的相互交联聚合而成的以氧梯度、葡萄糖分布、乳酸积累、DNA链断裂、ATP分布和组织形态学扩散为特征的完整的无血管体外肿瘤生长病理模型[16-19].MCTS的优势之一在于既有癌变细胞,癌变细胞的周围也有正常细胞.当球状体细胞达到一种临界直径时,它们便开始形成外部延伸区域、内部静止区域以及中央坏死区域,这些模型可以清晰地模仿癌症细胞的各种特征.使用MCTS模型,研究者可以揭示癌症药物如何渗透到异质肿瘤的3D结构中,并且可以揭示药物如何与肿瘤附近环境发生作用.研究表明:当球状体直径为400 μm时对内核的增值、再生、耐药性最理想[3].目前,最先进的3D分析技术可以用来评估肿瘤多细胞球体增殖和血管再生.Wang等[20]建立了在壳聚糖/胶原/海藻酸纤维支架(CCA)上培养MCF-7细胞运用于抗癌药物筛选的MCTS模型,发现与2D培养相比,3D培养的MCF-7细胞有更佳的耐药性和增值率,其新陈代谢也更接近体内的肿瘤细胞模式.

全球数十个国家的首脑摒气聆听这清丽而深情的朗读。此时的巴黎冷雨霏霏,凯旋门下场面庄严而壮观。第一次世界大战结束100周年纪念大会正在这里举行。

李丹丹等[21]研究发现:3D培养条件下的细胞模型具有更好的糖原储存能力,更高的敏感性.与2D模型相比,3D模型的药物代谢酶、转运体、核受体等的表达能力均有一定水平的提高.在3D培养条件下的细胞可更好地维持其极化状态,保持组织特有的功能[22-24].Smalley等[25]的研究表明:肿瘤细胞在2D与3D培养条件下RNA水平会出现数百个片段的差异.利用3D培养技术得到的模型可与LC-MS、细胞芯片和免疫组化技术等检测手段相结合[26-27],通过观察药物对细胞的病理作用和毒性,筛选特定化合物.牟朝丽[28]利用PHC多孔支架与结肠癌细胞共培养得到的细胞反应器与LC-MS联用,从朱砂七提取物中筛选出可与癌细胞特异性结合的马兜磷酸A和马兜磷酸B,并从中药桃儿七中筛选出了7种与癌细胞特异性结合的活性产物.

肿瘤干细胞(CSCs)是存在于恶性肿瘤细胞中为数极少却具有无限增殖、分化并具有自我更新能力的肿瘤细胞,它通过自身功能维持肿瘤微环境的不断更新,并且具有较强的耐药性.而3D培养的CSCs球体可以在体外激发其基因表达、肿瘤异质性和耐药性等功能,赋予模拟CSCs在生理中的能力,这样特殊的功能使得CSCs成为非常合适用以检测化合物对其抑制作用的体外功能系统[29-31].Subedi等[9]利用多功能干细胞(iPS)诱导CSCs,建立人工诱导型肿瘤干细胞(iCSCL)筛选平台,对6 000 种化合物进行了大规模筛选.由iPS诱导的CSCs具有癌细胞的特征并且可以稳定繁殖,可以用于CSCs的药物筛选.该研究从6 000 种化合物中初步筛选出了86 种对肿瘤可能有抑制效果的化合物,发现线粒体代谢功能障碍对癌细胞的抑制有重要作用,最终确定了青蒿琥酯可以通过诱导线粒体功能异常,从而抑制CSCs的繁殖扩散.除此之外,研究者们还通过蛋白质印记分析了Sox2基因在单层肿瘤细胞和球状肿瘤细胞中的表达能力,发现该基因在肿瘤球体中的表达明显高于在单层细胞中的表达.并且,iCSCL球体肿瘤对CSCs抑制剂盐霉素也更加敏感,表明iCSCL球体肿瘤比单层肿瘤细胞更适合于评估CSCs抑制剂的功效和选择性.

1.2 心血管疾病的3D细胞筛选模型

3D细胞筛选模型除了运用于肿瘤药物筛选外,研究者们也在尝试建立心肌细胞模型来检测具有心脏毒性的化合物[32].自从多功能心肌干细胞出现以来已成功构建了多种形式的3D心脏模型.心脏是人体内最重要的器官之一,负责提供压力使血液携带氧气和营养物质流向人体的各个部位.由于心肌细胞的再生能力低、自我修复力较差,使得心血管类的疾病成为世界范围性的最主要的致死疾病之一[33].除了心脏本身的疾病外,糖尿病及各种炎症治疗过程中各种药物的代谢副产物会随着血液流向心脏,对心脏产生毒性.这种情况在药物初步筛选过程中无法预估,导致许多化合物最终无法成药.现有的药物筛选平台中,通常使用的小鼠模型在电生理特性、耐药性和抗毒性等方面与人类心脏存在种属差异[34],并且存在周期过长等缺点.普通的高通量筛选等体外筛选方法与人体内环境在酸碱性、渗透压、化学组成等方面差异巨大,导致筛选准确性较低.基于体外筛选模型的缺陷,人们研究并建立了体外心脏3D模型[32].模仿天然心肌的3D组织的构建需要合适的细胞来源与可以支撑细胞生存、延展,并与宿主整合和血管化的生物材料[35].胚胎干细胞是从早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性.这些特性使由人胚胎干细胞分化得到的心肌细胞(hESC-CM)成为再生医学和疾病模型非常重要且有前途的细胞来源[36].在心脏模型中嵌入的hESC-CM的收缩性和舒张性可以反映药物对心脏的作用[37],而诱导性多功能心肌干细胞(hiPSC-CMs)可诱导患者自身体细胞形成iPSCs,具有潜在的疾病源特质,因此非常适合作为药物筛选模型[38].在国内,王慧玲等[39]已在Atelocollagen胶原支架上成功培养出了具有收缩功能的成年大鼠心肌细胞.Zhang[36]通过在胶原生物材料中包裹hESC-CM制造心肌纤维建立3D心脏模型,并发现在3D组织基质中添加hESC-CM和成纤维细胞可以促进心脏组织在结构上的成熟,建立的3D模型可以用于体外心脏成熟研究.在国际上,Serpooshan等[40]利用法拉第波使hiPSC-CMs迅速聚合成预先设置的三维结构.与天然心肌相比,在相同的细胞密度下,这些hiPSC-CM衍生的3D组织显示出更好的细胞存活力、代谢活性和细胞间连接力.

[7] 赵玲玲.细胞坏死抑制剂筛选模型的制备及中药抑制剂的筛选[D].长春:东北师范大学,2015.

(6)绿色生活。2017年国家发展改革委、环境保护部、国家统计局、中央组织部印发的绿色发展指标体系中包含绿色生活这一方面,结合农业发展过程,本文使用农村改厕的政府投资(亿元)与农林水事务(亿元)的比值来表示绿色生活,用x6表示。在农村,由于自然经济条件、思想观念、生活习惯等因素的影响,农村居民所使用的厕所比较简陋,老旧厕所不仅污染环境,还滋生各种病菌,危害村民身体健康。近年来政府大力推广农村改厕,并进行相应投资,改善农村环境,促进社会经济发展,同时提高了村民的身体健康水平。

1.3 药物毒性评价的3D细胞筛选模型

药物研发的过程中,新药的毒性以及耐药性的评价是极其重要的一步.药物毒性的检测一般是在体外细胞的药物敏感性实验中进行,但单层细胞结构过于简单,不能模拟药物所作用的实体三维空间结构,导致研究结果与其在患者体内临床评估的药效存在很大的偏差,造成体外培养细胞药物敏感性实验结果的临床参考意义受限,无法真实反映体内病理生理结构及状态[41-43].因此学者们致力于开发3D药物毒性评价的筛选模型以弥补2D细胞模型的不足.洪少馥[44]利用无血清悬浮培养法成功建立了人乳腺癌MCF-7和人鼻咽癌5-8F 3D肿瘤球模型,并且分别检测了两种肿瘤球与其同一类型单层细胞在细胞耐药、周期、药物敏感性和乏氧基因等方面的差异,结果显示形成肿瘤球后细胞的耐药性能增强,并且3D立体结构赋予了MCF-7和5-8F肿瘤球与体内实体肿瘤非常相似的乏氧特征.同时考察了超声福照联合紫杉醇在肿瘤球模型上的细胞毒性效应,证明了超声福照在适宜条件下可辅助増强肿瘤球对紫杉醇的药物敏感性.

药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)作为引起急慢性肝损伤和爆发性肝衰竭的主要因素,是影响新药安全的重要方面,也是研发者在新药开发过程中必须检测的项目.有研究表明:在德国和法国,由药物原因造成的肝损伤分别占肝病患者的32%和40%.许多药物临床失败、上市后撤回的主要原因之一就是DILI,这一点造成了资源与金钱的极大浪费,所以尽可能早地检测出药物的肝毒性至关重要[45].Tania等[46]以聚二甲基硅氧烷 (PDMS)为支架材料三维培养肝细胞,并将其整合到特定的生物反应器中以改善细胞培养物的营养和气体供应,通过产生的白蛋白和尿素来评估该模型的肝脏特异性功能,并以对乙酰氨基酚来对其安全性评价能力进行验证.结果发现:该模型的肝细胞彼此之间接触良好,在培养期间非常好地维持了培养物特异性酶功能,并且能够很好地用于临床前早期肝毒性的检测.

1.4 3D细胞模型的应用——芯片实验室

20世纪末,Harrison等[47]将毛细管电泳和样品注射系统集成到平面玻璃芯片上,首次提出以微机电加工技术为基础的“微型全分析系统”,即现在的芯片实验室.芯片实验室,指将样品反应、制备、分离、检测等基本操作集成到一块芯片上,在微通道内对纳升甚至皮升量级的液体进行精确操作以完成不同的生物或化学反应过程,并对产物进行分析的技术[48].芯片实验室用于药物的评价和筛选,具有快速、准确、便捷和高通量的特点.Choucha等[49]以HepG2/C3a细胞为研究对象,建立了肝癌模型的芯片实验室,并检测了癌细胞对氟他胺、羟基氟他胺的代谢应答,以探索前体药物的体外代谢过程和发挥抗肿瘤活性的二级代谢产物的毒理学特性.Choucha的HepG2/C3a细胞模型将芯片实验室这一新技术与药代动力学、药物毒性检测等传统药物评价手段相结合,在新药研发领域表现出巨大的应用前景,并且为体外药物评价与筛选提供了新的平台.

除单纯的药物筛选外,芯片实验室还可用于组织与器官的仿生建立.Huh等[50]从人的气孔和肺血管内皮同时提取细胞并置于膜的两侧培养,中间有培养介质通过,由此构建了一个仿生组织模仿肺泡-毛细血管界面.然后通过在组织两侧加装侧孔施以负压使整个结构可以模仿人呼吸一样舒张和收缩.通过以上方法可以将两种或两种以上的组织放在一起,创造出类似于人工器官的可称为芯片实验室的仿生模型.该模型具备了人工器官的基本特征,可以显示出与人体器官内相似的功能.这样的仿生模型虽然不能直接代替人工器官用于器官移植,但基本适用于疾病诊断、药物合成与筛选等领域.

2 结 论

3D细胞培养通过运用再造细胞外基质,能够模拟细胞在生物体内的生存环境,为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境,同时又能弥补在体内或2D条件下不能更好地对药效进行观察的缺陷.采用3D细胞作为药物筛选的模型,主要有几下几个优点:1) 与整体动物模型和组织器官模型相比,细胞模型的建模周期短且过程较为简便,可有效缩短筛选时间,节省人力、物力;2) 避免了因种属不同导致的药物在代谢及毒性方面的差异,排除了生理屏障对药物吸收的影响[51],从源头降低了新药在临床试验中失败的概率;3) 作用靶点明确,与高通量筛选、高内涵筛选等自动化的现代筛选手段结合,可以实现多靶点、多指标及多通道筛选,提高筛选效率;4) 细胞对外界环境变化反应灵敏,可以检测出复杂成分中极少量的目标化合物,具有微量化、高灵敏度等明显优势.虽然细胞筛选模型相对于动物或组织筛选模型有许多优势,但也仍然存在很多需要解决的问题.例如,由于细胞感知外界环境变化的能力,导致其对温度、酸碱性和湿度环境等要求非常高,很小的变化都有可能导致细胞的死亡或变异.另外,3D细胞模型仍处于发展状态,目前的技术还仅仅停留在建模水平,只有极少数的模型被证明可用于药物筛选.与此同时,3D细胞模型虽然解决了空间差异对药物活性的影响,但与2D细胞模型一样,无法筛选出不能穿过血脑屏障等人体防御系统的化合物.此类化合物可以有效作用于细胞靶点,但是在人体中无法直达病理部位,在一定程度上限制了细胞筛选模型的发展.对于如何克服细胞筛选模型的这些缺陷目前还有待研究,但相信随着3D细胞及相关技术的不断发展,这些问题都可以一一解决,3D细胞模型会有更广阔的发展.同时,也将会有更多种类的细胞用于不同筛选模型的构建.

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目前,通过细胞培养和组织工程构建3D心脏模型的手段以趋于成熟,也已经用于再生医学、器官移植和药物测试等多方面的研究,相信不久以后,用于筛选的3D心脏模型会成为心血管类疾病治疗药物的主要筛选方法.

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化学是一门以实验为基础的自然科学,在化学课堂教学中实验是必不可少的,它是化学学习的基础,是学生认识和学习化学的重要工具和载体。在实际教学中,教师应结合具体情况,对课堂教学内容进行适当的实验拓展,或丰富、或改进,以提高课堂教学的趣味性、探究性和创新性,进而培养学生爱化学、学化学的志趣及其思维能力、探究能力和创新精神,拓宽学生实践和创新的途径,提升学生的化学学科素养。

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底层驱动包含PCIE驱动和DMA高速接口,PCIE驱动负责探测设备、发现设备并注册设备到系统中,并根据硬件特性进行设备初始化配置,实现操作底层设备以及卸载设备。DMA高速接口采用In/Out双队列机制实现系统和加密设备之间数据的高速传输。DMA传输可以较少占用系统资源,极大地提高了数据传输带宽。

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与核形石、藻叠层的对比发现,生物鲕层的形成过程为:当鲕粒变大,不能悬浮时,相互的碰撞、摩擦就少了,微生物就较长时间的附着其上。有微生物的参与,低能鲕层的生长较快,所以形成的层理较厚,且富含有机质。

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(6)浇筑独立基础及防水板混凝土:钢筋工程隐蔽、模板工程的预检、安装工程隐蔽验收等项目已经监理和建设单位的验收,混凝土浇灌令由项目管理人员会签并经监理工程师签认完毕。管理人员和施工操作人员(包括试验、水电工等)安排就位,并向施工操作人员进行详细的技术安全交底。混凝土浇筑中所用机械设备调试就位,挑选有丰富施工经验和劳动技能的专业施工人员负责混凝土的振捣,由具有一定管理经验、思想素质高、技术过硬的班组长带班,协调班组人员。

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我喊了一顿饭工夫,狼剩儿连影子都冇见到!事情惊动了姜大爹他们。旺明叔敲响了祠堂的大钟,各家各户主事的都聚到姜家祠堂前的场子上;十几家杨姓外来户,据说是当年闯王南下队伍的后人,他们也都照惯例来了。姜大爹说,狼剩儿不见了,这无缘无故损丁折口,在河浦塆还是头一遭,这个恶例开不得!女将都回去,房前屋后旮旮旯旯,多找几遍!男将点起火把,方圆十里大路小道儿,沟渠河汊,过细找找!

从以上穿透曲线图中可以看出,由于ZK2和ZK3位于填埋场下游边界,一旦填埋场发生渗漏,约200 d即可在ZK2和ZK3监测井监测到填埋场特征污染物超标浓度,且表层监测到的特征污染物浓度远大于底层。

[49] CHOUCHA S L, BUNESCU A, NAUDOT M, et al. Metabolomics-on-a-chip of hepatotoxicity induced by anticancer drug flutamide and its active metabolite hydroxyflutamide using HepG2/C3a microfluidic biochips[J].Toxicological sciences, 2013, 132(1):8-38.

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到底为什么会有屋面曲线的设计?因为历史上没有文字记载,大家都在议论与猜测,如果你有更科学的解释,请记得告诉我呀!

[51] 鲁萌,周芳,刘嘉莉,等.三维细胞模型在抗肿瘤药物早期药代动力学筛选中的应用进展[J].中国临床药理学与治疗学,2017,22(3):342-349.

模块化信息处理的开发,可以基于类似Java这种面向对象的程序设计语言。Java技术具有卓越的通用性、安全性、高效性和平台移植性。Java编程语言能将信息进行模块化处理,对其进行分类,在通过将Java嵌入到计算机软件中,针对不同的服务对象和受众群体,构建全面、准确的信息数据平台[12]。

侯晓蓉,郭倩,杨佳佳,单伟光
《发酵科技通讯》 2018年第01期
《发酵科技通讯》2018年第01期文献

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