白及Bletilla striat为兰科白及属(Bletilla Rchb．f．)植物，为多年生宿根草本，地下部假鳞茎块根状，又称良姜、紫兰、甘根、连及草，为我国传统中药材[1-2]，1977年以后各版《中国药典》均有收载。白及味苦、甘、涩，性微寒，归肺、肝、胃经，具有收敛止血,消肿生肌的功能，主要用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、肺结核咯血、溃疡病出血等[3-5]。现代研究发现白及块根含有近50种化合物[6]，在医药、化工、食品等方面的应用前景十分广阔[7-12]，综合利用潜力很大。近年来白及野生资源遭到了无限制采挖，加上生态环境的破坏，野生资源量急剧减少，价格也逐年攀升[13]，已被我国列为珍稀濒危保护植物，同时也被列入《濒危动植物种国际贸易公约》(CITES)的附录Ⅱ中，受到国际保护，因此需要引导和开展人工栽培满足市场需求及保护野生白及资源。长期以来白及栽培以分割假鳞茎的方式进行繁殖，不仅繁殖系数低、周期长、耗种量大，且易导致病毒累积，经济效益不佳。白及种子非常细小且无胚乳，自然条件下萌发率极低，而种子非共生培养则能获得萌发，已有白及播种繁育种苗的研究报道[14-17]，但关于白及种子非共生培养高效萌发体系的系统研究较少[18]，高中南等[18]综述了白芨蒴果的贮藏及其消毒方法、非共生萌发的最适培养方法以及提高萌发率等研究进展，但相关研究有待进一步改进。为此，本研究比较了白及种子的播种方式、接种量、贮藏方法、光照条件及培养基添加物等对种子萌发的影响，旨在建立白及种子高效萌发的培养体系，为实现白及种苗的工厂化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

白及蒴果采自中国医学科学院药用植物所北京药用植物园，并经林余霖研究员鉴定为白及Bletilla striat，系兰科白及属(Bletilla Rchb.f.)植物。

1.2 方法

1.2.1 蒴果的消毒处理 将新鲜蒴果(除贮藏试验外)用75%的酒精浸泡0.5～1.0 min后，置于10% 的次氯酸钠溶液中消毒10 min，再用无菌水冲洗4～5次后，用无菌手术刀将果荚前后端各切下1 cm左右，再沿中间段纵切，然后用不同方法播种。

1.2.2 种子萌发培养 经消毒的种子用悬液法(除播种法试验外)接种到MS添加土豆泥5%(除添加物试验外)的培养基上。培养基中均添加琼脂粉7 g·L-1、白糖20 g·L-1，pH 5.2～5.6。除光照度试验外，种子接种后置于温度(20±2)℃的黑暗条件下培养。萌发后统计萌发率，并转瓶继代培养。培养瓶采用650 mL的兰花瓶。

1.2.3 播种法比较 于蒴果表面消毒后进行。比较撒播法、涂布法和悬液法3种把种子接种到培养基表面的方法。撒播法指用无菌镊子夹住纵切后蒴果外壳的一端，将种子轻轻抖落到培养基表面，摇晃培养瓶利用培养基表面的少许水使种子尽可能分布均匀。涂布法指先向培养基上撒播种子，再滴入1～2滴无菌水，用药勺或涂布器涂布使种子尽可能分布均匀。悬液法指将种子抖落到一定量的无菌水中并轻晃瓶子使种子在无菌水中扩散均匀成悬浮液，再取悬浮液接种于培养基表面。

1.2.4 播种量比较 将发育正常的一个蒴果种子悬浮于10、20、50和100 mL的无菌水中，分别获得的悬浮液称之为A、B、C和D悬浮液，含量大约为1×104、5×103、 2×103和 1×103粒·mL-1，然后用一次性注射器各吸取1 mL悬液种子接种于培养基上，轻晃培养瓶即可。

1.2.5 光照条件比较 设黑暗与不同光照时间共3种处理，处理设置：L1为24 h全黑暗培养，L2为光照度1 200～1 600 lx下每日光照8～10 h，L3为全黑暗培养15 d后转入以上光照度下光照培养。

1.2.6 贮藏方法比较 将新鲜蒴果随机分为5份，1份当即接种为对照，其余4份蒴果分别用牛皮纸袋和塑料封口袋包装，分别贮藏于(20±2)℃的培养室、4℃冰箱冷藏室中，于贮藏0、5、10、20、30、50、70、90 d后用相同的培养方法于相同的条件下萌发。处理设置：S1为牛皮纸袋装室温贮藏，S2为塑料袋装室温贮藏，S3为牛皮纸袋装4℃冰箱贮藏，S4为塑料袋装4℃冰箱贮藏。

1.2.7 添加物比较 设MS+蔗糖20 g·L-1为对照(CK)，在此基础上分别添加椰子汁、马铃薯和香蕉等共5种不同添加物(马铃薯和成熟香蕉均采用剥皮称量后，切成小碎块用豆浆机研磨成泥使用)。处理设置：A1为添加椰子汁50 mL·L-1，A2为添加椰子汁100 mL·L-1，A3为添加马铃薯100 g·L-1，A4为添加香蕉100 g·L-1，A5为添加椰子汁50 mL·L-1+马铃薯50 g·L-1。

1.2.8 观察统计 每个处理30瓶，10瓶一个重复。播种7 d后，用放大镜观察种子萌发情况，记录最早萌发日期及形态、大小、色泽等生长情况，播种30 d后，无菌条件下从培养瓶中5个不同位置取出小块培养基，切成1 cm的小块，于放大镜下观察计数，求得种子萌发率，每个处理的萌发率即为每个处理15块培养基萌发率的平均值。种子吸水膨大开始出现白色原球茎视为萌发。

2 结果与分析

2.1 播种法对白及种子萌发的影响

观察发现，撒播法、涂布法与悬液法无菌播种白及种子各有优缺点，撒播法简单易行，但是无法控制播种量，种子成团、分散不均匀，造成部分种子无法接触培养基而不能萌发，原球茎小，玻璃化严重，易黄化、死亡。涂布法种子分布较均匀，但是接种过程需要添加无菌水及借助涂布器等工具，增加了污染机会。悬液法接种的效果最佳，种子悬浮于无菌水中易于控制播种量，且分布均匀，但操作麻烦，稍有不慎易发生大面积污染。从萌发率来看(图1)，总体上悬浮液无菌播种的萌发率要高于其他两种方式，在培养40 d时，悬浮液无菌播种的萌发率达到最高(88.0%)，涂布法为85.4%，撒播法为83.5%。随培养时间增长，萌发率总体上呈现先升后降的趋势，因此选择培养时间在40 d左右为佳。

采用SPSS 20.0统计学软件对该研究所得数据进行处理和分析，计量资料采用（±s）表示，用 t检验，计数资料采用[n（%）表示，用 χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

图1 不同播种法对白及种子萌发率的影响 Fig.1 Effects of sowing ways on germination rate of Bletilla striata

2.2 播种量对白及种子萌发的影响

4种不同含量白及种子悬浮液的萌发结果表明(图2)，A和B悬液的种子播种后10 d左右萌动，但萌发不完全，原球茎多层积压，40 d时萌发率分别为(73.5±0.52)%和(81.3±0.91)%，随后上层的原球茎出现黄化、死亡，不能继续生长和分化，60 d统计萌发率下降。D悬液的种子分散均匀，但萌发最迟，始萌发时间为13～15 d，原球茎松散，萌发率为(89.0±1.59)%。C悬液种子萌发迅速，始萌发时间7～9 d，原球茎分散均匀、健壮整齐、生长势强，萌发率高达(95.2±0.17)%，明显优于其他3种播种量及撒播法和涂布法的萌发率。撒播法播种60 d后，底部原球茎黄化透明，顶部原球茎由于接触不到培养基逐渐枯死，萌发率下降明显。

图2 不同播种量对白及种子萌发率的影响 Fig.2 Effects of seedling rates on germination rate of Bletilla striata

2.3 贮藏方法对白及种子萌发率的影响

已有研究表明[15]，培养基中添加椰子汁不仅促进白及种子的萌发，还可提早萌发时间，本试验结果也证明添加椰汁和马铃薯均对白及种子萌发有促进作用，椰汁能提早种子萌发但形成的原球茎易玻璃化，椰汁不同用量对白及种子萌发率的影响不大，而添加香蕉则不利于白及种子萌发。

常温贮藏20 d左右蒴果陆续开裂，S1和S2处理萌发率迅速下降，30 d时降至35%～40%，所形成的原球茎弱小，部分原球茎生长一段时间后停止生长，褐化死亡，2个月后失去萌发能力。而4℃冷藏20 d后的萌发率极显著高于20℃贮藏。S3贮藏40 d后萌发率迅速下降，贮藏50 d的萌发率仅剩40%，而S4贮藏法萌发率的拐点出现在贮藏50 d后，60 d时仍有一半萌发，S4萌发率显著高于S3。S1和S2贮藏40 d时始萌发时间突增至63～65 d，曲线出现拐点，70 d时均增至95 d，牛皮纸袋与塑料袋两种包装方法之间无差异。S4处理贮藏20 d的始萌发时间从8 d缩短至6 d，贮藏50 d时延长至42 d，不同包装冷藏处理的始萌发时间40 d后出现差别，相差10～12 d，始萌发时间的变化拐点较室温贮藏推迟了10 d(图4)。可见冰箱低温贮藏利于保存白及种子，不同包装处理在室温下无异，低温下则差异明显。

图3 贮藏方法对白及种子萌发率的影响 Fig.3 Effects of storage ways on germination rate of Bletilla striata 注：S1为牛皮纸袋装室温贮藏，S2为塑料袋装室温贮藏，S3为牛皮纸袋装4℃冰箱贮藏，S4为塑料袋装4℃冰箱贮藏；图4同。

图4 贮藏方法对白及种子始萌发时间的影响 Fig.4 Effects of sowing ways on the beginning of germination of Bletilla striata

2.4 光照对白及种子萌发率的影响

观察两组患者的治疗效果，观察两组患者的护理满意度及生活质量。生活质量采用SF-36量表评分，得分越高，生活质量越高。

图5 光照条件对白及种子萌发高峰期的影响 Fig.5 Effects of light conditions on germination peaks of Bletilla striata 注：L1为24 h全黑暗培养，L2为每日光照8～10 h，L3为全黑暗培养15 d后转入光照培养。

2.5 添加物对白及种子萌发率的影响

贮藏处理的白及种子始萌发时间和各自的萌发率均呈现阶梯状规律，揭示了白及种子贮藏过程中的活力衰变，种子萌发率随贮藏时间的延长而降低。4℃密封条件利于白及种子保存，贮藏2个月仍有一半种子萌发，20℃左右的温度则加速种子代谢和衰老，很快就失去萌发能力。该结果与赵仁全等[25-26]在白及和金线莲种子贮藏试验的结果相似。

图6 有机添加物对白及种子萌发率的影响 Fig.6 Effects of organic additives on germination rate of Bletilla striata 注：图中添加物A1～A5分别为添加椰子汁50 mL·L-1、添加椰子汁100 mL·L-1、添加马铃薯100 g·L-1、添加香蕉100 g·L-1、添加椰子汁50 mL·L-1+马铃薯50 g·L-1。

添加椰汁的种子最早萌发，始萌发时间提早至6 d，萌发的原球茎体积较大，淡绿色，较松散，50 d后基部透明状增殖，出现玻璃化趋势。添加土豆泥的培养基上种子始萌发时间为8 d左右，原球茎结实，绿色，生长势强，50 d后原球茎顶端分化出叶原基。

3 讨论与结论

已有研究表明兰科植物种子萌发对光照的反应具有种的特异性[27]。本研究结果表明白及种子先暗培养15 d后再行光照，萌发率达93%以上，显著高于全黑暗培养和光照培养(8～10 h·d-1)处理，可见黑暗处理能显著促进白及种子萌动，但种子萌发需要光照条件，这可能与白及的地生习性有关，种子播种后需经历类似土壤中的黑暗环境之后才能萌发，与陈莹等[28-29]在兜兰属种子萌发的研究结果一致，与喻苏琴等[17]在白及上的结果不同，和寿星等[30]则认为白及种子在全暗培养下萌发后需要光照才能生长正常。

结果表明(图6)，椰汁、土豆泥和香蕉等有机添加物对白及种子萌发有一定的影响作用。添加香蕉的处理萌发率最低，仅有40%，而其余4种处理都能取得不错的萌发率为81.63%～93.01%。可见，土豆、椰汁均对白及种子萌发有促进作用，萌发率达80%以上；椰汁不同用量间萌发率为81.63%～86.52%，促进作用差异不大，而添加香蕉则不利于白及种子萌发。

利用种子离体培养是繁殖和保护兰科植物野生资源的重要手段之一[19]，白及、石斛和兜兰等兰科植物的种子培养已成功获得种苗[17，20-21]。有关兰科植物种子的播种方法和播种量的研究报道较少，仅见陈超等[22]对蝴蝶兰种子无菌播种法及其播种量做了比较，魏翠华等[23]采用微滴法播种蝴蝶兰种子，但未深入探讨适宜的种子含量。本研究发现，白及种子萌动的速度与接种的种子量有关，用量高的萌动快，表现出明显的群体优势效应，用量较小的则群体效应减弱，萌发迟缓，与前人研究结果[22,24]相似。本研究进一步明确了白及悬液法播种易于控制播种量的优点，但需要严格掌握无菌操作以降低污染率，播种量以500～630 mL培养瓶中加入2×103～5×103粒·mL-1为宜。

试验观察发现，光照处理8～10 h·d-1时，始萌发需要6～8 d，萌发率≤80%；全黑暗时，始萌发需要10～15 d，萌发率>85%；黑暗15 d后转入光照培养，始萌发需要10～15 d，萌发率≥93%。光照对白及种子萌发及其萌发高峰期有影响，光照处理下的白及种子萌发较早，播种后6～8 d就突破种皮萌发，萌发高峰期主要集中在种子萌发后的5～10 d，经历大约5 d，萌发时间集中，但很快就停止，萌发率最低仅80%左右。黑暗下培养需要10～15 d才萌动，L3处理于暗培养15 d后转入光照时出现萌发高峰，转入光照5～7 d之后有生活力的种子基本上萌发完毕，萌发率最高达93%，原球茎绿色、个体大，生长势强；而全程暗培养的种子萌发高峰期持续时间长，峰高介于两者之间，原球茎淡绿色。

白及种子萌发率和始萌发时间与贮藏方法、贮藏时间关系密切(图3～4)，4种方法贮藏的白及种子，其始萌发时间、萌发率均有相似的变化趋势。贮藏10 d内，各方法的始萌发时间为6～10 d，萌发率相近，原球茎壮实饱满。之后萌发率随着贮藏时间的延长而降低，始萌发时间则增加。

增值税小规模纳税人采取简易计税方法，即应纳增值税税额=不含税销售额×税率。为了更好地分析“营改增”对生产性服务业小规模纳税人的影响，现做以下前提假设：假设1，企业的应税销售额为R，成本为C且企业“营改增”前后销售额保持不变；假设2：“营改增”前后企业不存在混合销售及兼营行为，即“营改增”前企业就其应税行为缴纳营业税，“营改增”后企业就其应税行为缴纳增值税；假设3：企业不存在营业外收入与营业外支出，仅就其销售收入、成本与相关税费计算其所得。表1为适用3%征收率的小规模纳税人“营改增”前后税负变化情况，表2为“营改增”前后适用5%征收率的小规模纳税人税负变动情况。

预热器、蒸发器接受热水的热量，将工质R245fa加热成高温高压的蒸汽（非水蒸气），然后进入膨胀机推动转子做功，同时降温降压。蒸汽从膨胀机排出后，进入油分离器，分离润滑油，气体进入冷凝器冷凝成液体，液体被液体泵升压，进入预热器、蒸发器，完成一轮循环，见图1。

胚培养技术是兰科植物繁育的有效途径之一[31]，利用种子萌发进行白及繁殖，在短时间里可以获得大量小苗，是一种快速有效的繁殖方法。本研究建立白及种子非共生培养的高效萌发体系，为快速繁殖白及种苗具有很好的参考价值，为规模化生产提供了技术上的可能性。

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