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建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究

更新时间:2016-07-05

建兰Cymbidium ensifolium是兰科Orchidaceae兰属Cymbidium多年生单子叶草本植物,在我国民间有着悠久的栽培历史,植物学界以其主产地福建命名,是福建传统特色花卉及主要出口创汇花卉[1]。现阶段,建兰在福建省的种植模式以设施栽培为主,随着种植面积的扩大和集约化栽培程度的提高,茎腐病的发生逐年加重,影响了建兰的生长发育和观赏、经济价值,做好该病的防控工作显得尤为重要,故需通过研究明确其发生及为害情况、病原菌种类及生物学特性、田间快速检测及防控策略等。福建省农业科学院植物保护研究所花果病虫害生态调控课题组已在漳州、龙岩和三明等地建兰种植区实地调查了茎腐病的发生及为害情况,并对该病的病原菌进行了分离、纯化和培养,通过致病性测定及rDNA-ITS和actin(肌动蛋白)基因序列分析,证明病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum,这是该病原菌侵染导致建兰茎腐病在国内外的首次报道[4]。本研究在此基础上,室内测定了温度、pH值、光照、碳氮源对该病原菌生长和产孢量的影响,以及病原菌孢子的致死温度及时间,以明确建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性,为有效防控该病害的发生与蔓延提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporum,从漳州、龙岩和三明等地建兰种植区采集的茎腐病病株中分离、纯化和培养得到,其ITSACT基因序列在GenBank上登录(登录号:KY798315、KY798316、KY798317和KY798318),菌株保存和活化均采用PDA培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 温度对病原菌生长和产孢量的影响 参考姚锦爱等[3-4]的方法,取菌龄一致、直径5 mm的菌苔接种于PDA培养基平板(d=9.0 cm,下同)中央,后分别置于5、10、15、20、25、28、30、35和40℃等9个温度的培养箱中黑暗培养,每个处理3次重复;培养7 d后,用十字交叉法测定菌落直径[5];再往每个处理的培养皿中加入10 mL无菌水,用灭菌玻片刮下分生孢子配制成孢子液,经3层纱布过滤后,用纽鲍尔(Neubauer)血球计数板在B203LEDTR型生物显微镜下观察、测定每个处理的产孢量。

1.2.2 pH值对病原菌生长和产孢量的影响 取高压灭菌后的PDA培养基保温在50℃水浴中,经无菌操作用0.1 mol·L-1 HCl或0.1 mol·L-1 NaOH溶液将PDA培养基pH值调节成3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等9个酸碱度,每个处理3次重复,再倒平板;待平板冷却后接入菌龄一致、直径5 mm的菌苔,于25℃培养箱中黑暗培养7 d后,采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.3 光照对病原菌生长和产孢量的影响 取菌龄一致、直径5 mm的菌苔接种于pH值为7的PDA培养基平板,后分别置于完全光照(3 000 lx荧光灯)、完全黑暗和12 h光暗交替等3种光照条件的25℃光照培养箱中培养,每个处理3次重复;培养7 d后,采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.4 碳源对病原菌生长和产孢量的影响 采用真菌生理培养基(NaNO3 1.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、碳源5.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1 000 mL)为基础培养基,分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、a-乳糖、甘露醇和淀粉等为碳源,制成7种pH值为7的培养基平板[3],以不加碳源为对照(CK),共8个处理,每个处理3次重复;在7种培养基平板和对照中,分别接入1块菌龄一致、直径5 mm的菌苔,再置于25℃的培养箱,12 h光暗交替培养7 d,后采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.5 氮源对病原菌生长和产孢量的影响 采用真菌生理培养基(氮源1.0 g、琼脂15.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、a-乳糖 5.0 g、蒸馏水1 000 mL)为基础培养基,分别以KNO3、NH4Cl、NH4NO3、NaNO2、赖氨酸等为氮源,制成5种pH值为7的培养基平板[3],以不加氮源为对照(CK),共6个处理,每个处理3次重复;在5种培养基平板和对照中,分别接入1块菌龄一致、直径5 mm的菌苔,再置于25℃的培养箱,12 h光暗交替培养7 d,后采用1.2.1的方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.6 病原菌孢子致死温度及时间的测定 以上述试验结果为条件培养病原菌7 d,后往培养皿中加入适量无菌水,在400倍生物显微镜下配制每视野20~30个孢子的悬浮液;取18个2 mL离心管,每管加1 mL孢子悬浮液,分别置于45、50、55℃的恒温水浴锅中5、10、15、20、25和30 min,后迅速将离心管再浸入4℃水中冷却,每个处理取60 μL孢子悬浮液于洁净载玻片上制成悬滴,放入培养皿一同置于25℃的光照培养箱中黑暗、保湿培养12 h,后将载玻片置于400倍生物显微镜下统计孢子萌发率(每处理统计300个孢子)。

1.3 数据统计与分析

利用DPS 7.05数据处理软件的DMRT检验法,对该病原菌在不同温度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落直径和产孢量,以及病原菌孢子在不同高温及水浴时间下的孢子萌发率进行多重比较,分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 温度对病原菌生长和产孢量的影响

由表1可知,病原菌在5℃和40℃时无法生长,在其他7个温度时均能生长;病原菌在5、10和40℃时无法产孢,在其他6个温度时均能产孢。生长速度以28℃最快,培养7 d后菌落直径可达85.30 mm,显著大于其他8个处理;其次是25℃和30℃,生长也较快,两者差异不显著;后依次是20、15、35和10℃,相互间差异显著。产孢量以25℃最高,每皿达58.73×106孢子,显著大于其他8个处理;后依次是28、30、20、35和15℃,相互间差异显著。综合评判病原菌的生长和产孢量,推定该病原菌培养的最适温度为25℃,在此温度下病原菌既能快速生长,又能获得最高产孢量。

据了解,山西拟投资380亿元,重点实施水污染防治、河流生态补水、河流源头保护、河湖水系综合整治、地下水超采治理和岩溶大泉保护及节约用水等“六大工程”,开展汾河流域生态保护与修复治理。山西今后将在汾河先行试点的基础上,进一步总结经验,逐步组建滹沱河、漳河、沁河等7个流域投资公司,形成“1+7+N”(1个省属水务企业,7个流域投资公司,N个区域公司)生态环境治理的市场化运作体系。

据现有报道,从香荚兰病株中分离出的尖孢镰刀菌,生长最适温度为28℃、光照条件为12 h光暗交替,病原菌孢子的致死温度及时间为58℃水浴10 min[11];从墨兰病株中分离出的尖孢镰刀菌,生长及产孢的最适温度分别为26℃、pH值为6~7、光照条件为完全光照、碳源为可溶性淀粉、氮源为蛋白胨,病原菌孢子的致死温度及时间为48℃水浴25 min或50℃水浴5 min或55℃水浴2 min[12];从兜兰病株中分离出的尖孢镰刀菌,生长及产孢的最适温度分别为27℃和24℃、pH值分别为6和7、光照条件为完全光照、碳源为乳糖、氮源分别为KNO3和NaNO2,病原菌孢子的致死温度及时间为55℃水浴5 min[10]。比对本研究结果,可以看出不同地域或兰科寄主植物上尖孢镰刀菌的生物学特性存在一定差异,这可能是由于长期生长条件不同引起病原菌部分相关基因表达差异所致。

1 温度对病原菌生长和产孢量的影响 Table 1 Effects of temperature on hypha growth and sporulation of F. oxysporum

温度/℃菌落直径/mm产孢量/(×106孢子·皿-1)55 00±0 00g0 00±0 00e1015 03±0 64f0 00±0 00e1534 23±0 71d1 48±0 05e2067 47±0 55c18 40±0 62d2583 80±0 36b58 73±1 95a2885 30±0 80a37 50±1 25b3083 43±0 60b22 13±0 85c3522 37±0 90e1 17±0 31e405 00±0 00g0 00±0 00e

注:表中同列不同字母表示差异显著(P<0.05),下表同。

2.2 pH值对病原菌生长和产孢量的影响

由图3可知,病原菌在7种碳源和对照(CK)中均能生长和产孢。生长速度以a-乳糖最快,培养7 d后菌落直径可达60.33 mm,显著大于其他6个处理和对照(CK);接着依次为麦芽糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖和甘露醇;最后是对照(CK),显著小于其他处理。产孢量也以a-乳糖最高,达37.97×106孢子·皿-1,显著大于其他6个处理和对照(CK);接着依次为甘露醇、淀粉、蔗糖和葡萄糖、对照(CK)、麦芽糖和D-果糖。可见a-乳糖是保证病原菌生长及产孢的最适碳源。

图1 pH值对病原菌生长和产孢量的影响 Fig.1 Effects of pH on hypha growth and sporulation of F. oxysporum 注:图中同列不同字母表示差异显著(P<0.05),下图同。

2.3 光照对病原菌生长和产孢量的影响

对价格因素进行敏感性分析,假设2中药物的价格均在目前的基础上下调10%,ALT复常率、HBV‐DNA转阴率及HBeAg转阴率的成本‐效果分析与表4基本一致,见表5。

图2 光照对病原菌生长和产孢量的影响 Fig.2 Effects of photoperiod on hypha growth and sporulation of F. oxysporum

2.4 碳源对病原菌生长和产孢量的影响

由图1可知,病原菌在pH值3~11时均能生长和产孢。生长速度以pH值6和7最快,培养7 d后菌落直径可达84.33和84.00 mm,两者差异不显著,但显著大于其他7个处理;其余依次为pH值5、8、9、4、10、11和3。产孢量以pH 值7时最高,达59.77×106孢子·皿-1,显著大于其他8个处理;后依次是pH值6、5、8、9、10和4,相互间差异显著;pH值11和3较低,最多也仅4.63×106孢子·皿-1,显著低于其他处理。可见该病原菌培养的最适pH值为7。

图3 碳源对病原菌生长和产孢量的影响 Fig.3 Effects of carbon source on hypha growth and sporulation of F. oxysporum

2.5 氮源对病原菌生长和产孢量的影响

由表2可知,病原菌孢子在45℃和50℃水浴中处理,孢子均有萌发,但是30 min处理萌发率很低,分别只有5.04%和0.49%;在55℃水浴中处理5 min,病原菌孢子已无法萌发。可见,病原菌孢子的致死温度及时间为55℃水浴5 min。

图4 氮源对病原菌生长和产孢量的影响 Fig.4 Effects of nitrogen source on hypha growth and sporulation of F. oxysporum

2.6 病原菌孢子致死温度及时间

由图4可知,病原菌在5种氮源和对照(CK)中均能生长和产孢。生长速度以KNO3最快,培养7 d后菌落直径可达59.67 mm,显著大于其他4个处理和对照(CK);其余依次为赖氨酸、对照(CK)、NaNO2、NH4NO3、NH4Cl。产孢量以NaNO2最高,达33.17×106孢子·皿-1,显著大于其他4个处理和对照(CK);后依次是赖氨酸、KNO3和NH4Cl;NH4NO3和对照(CK)较低,显著低于其他处理。综合评判病原菌的生长和产孢量,推定该病原菌培养的最适氮源为NaNO2,该氮源不仅能保证病原菌快速生长,而且能保证获得最高产孢量。

由图2可知,病原菌在3种光照条件下均能生长和产孢。生长速度和产孢量,均以12 h光暗交替最快和最高,培养7 d后菌落直径和产孢量分别达87.33 mm和58.57×106孢子·皿-1,均显著大于其他2个处理;其次是完全黑暗,最后是完全光照,两者差异显著。可见,12 h光暗交替是保证病原菌生长及产孢的最适光照条件。

2 病原菌孢子的致死温度及时间 Table 2 Lethal temperature and time of F. oxysporum spores

时间/min病原菌孢子萌发率/%45℃50℃55℃544 35±1 10a32 37±1 28a01040 69±1 67b21 08±1 72b01531 45±0 72c2 91±0 59c02021 25±1 511d2 02±0 13c0259 15±0 43e1 87±0 08c0305 04±0 67f0 49±0 10d0

3 讨论与结论

茎腐病是兰花规模化生产中最严重的病害之一,感病植株的死亡率高达20%~30%,被称为兰科植物的不治之症[6]。已报道能引起兰科植物茎腐病的病原菌有多种,其中尖孢镰刀菌可侵染建兰C.ensifolium、墨兰C.sinense、香草兰Vanilla fragrans、石斛兰Dendrobium Orchid和兜兰Paphiopedilum corrugatum等发生茎腐病害[2,7-10],其生物学特性研究涉及的寄主植物有香荚兰(香草兰)、墨兰和兜兰[10-12],以建兰为寄主植物的相关研究未见报道。

前15天给予匹多莫德颗粒(天津金世制药有限公司生产,国药准字H20030225)400mg/次,2次/d,然后减少至1次/d,共持续治疗1个月。期间同时应用抗生素、抗病毒药物进行对症治疗。

工程区处于相对稳定区域,地震动加速度反应谱特征周期为0.40 s,地震动峰值加速度为0.10 g,相应地震基本烈度为Ⅶ度。库区不存在向两岸永久渗漏问题,无浸没问题。岸坡较少缓倾结构面,库岸无大方量滑坡的危险。

本研究还发现建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌受温度的影响较大,35℃以上的高温和15℃以下的低温对病原菌生长、产孢及孢子萌发有明显的抑制作用。本研究结果表明最适培养温度为25℃,但在此温度下病原菌的菌落直径低于28℃,后继需在25~30℃间设置更多温度梯度,进一步观察其生长及产孢情况,更加精准地确定出病原菌侵染的最适温度。同时,适宜的碳氮源也是尖孢镰刀菌生长及产孢的必备条件,本研究推定的氮源NaNO2对病原菌产孢很好,但对菌丝的生长作用比KNO3、赖氨酸和对照都低,后继应进一步扩大氮源的筛选范围,选择出同时促进病原菌生长及产孢的最佳氮源。

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生长及产孢条件通过本研究已基本明确,据此生物学特性建议:种植前对栽培基质及相关设施进行短时间高温闷棚处理,尽可能杀灭病原菌。种植期间根据建兰的生长情况,合理施肥,适度增加土壤酸性并延长或减少光照时间,抑制病原菌生长和产孢,增强兰株抗病性;同时应强化绿色防控技术的集成应用,多选用对该病原菌防控效果好的生防菌,以防止建兰受茎腐病菌侵染为害。

参考文献:

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[12]刘智成,刘爱媛,冯淑杰,等.墨兰茎腐病原菌生物学特性研究[J].中国园艺文摘,2009,25(4):28-31.

姚锦爱,黄鹏,陈峰,余德亿
《福建农业学报》 2018年第02期
《福建农业学报》2018年第02期文献

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