结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，在全世界癌症相关死亡原因中排第3位[1]。2011年我国CRC的发病率和病死率分别为23.03/100 000和11.11/100 000，且发病率较以往明显升高，多数患者确诊时已属中晚期[2]。2017年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)指南推荐，晚期转移性结肠癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)患者采取以手术为主、化疗为辅的综合治疗方案，含有奥沙利铂(L-OHP)的FOLFOX及CAPOX方案为一线化疗方案。然而，采用标准化治疗方案的晚期患者5年生存率不足10%[3]，主要原因是肿瘤细胞对化疗药物的抵抗作用，导致L-OHP的应用受到较大的限制。目前，针对L-OHP耐药的研究仍缺乏有效进展，其耐药机制仍在探索中。

HOX基因又名Ⅰ型同源异形盒基因，是一类在进化上高度保守的基因家族。HOX基因通过调控凋亡、增殖等参与脊椎动物胚胎发育和器官形成过程。近年研究发现，HOX基因表达的改变与肿瘤的发生、发展密切相关[4]。笔者前期研究显示，在术前接受含L-OHP化疗方案的mCRC患者中，基因芯片发现响应与不响应组中HOXB8基因呈现显著的差异表达，免疫组织化学检测也验证了上述发现[5-6]。但目前尚无研究显示，HOXB8在肠癌耐药细胞系中是否有相同的差异表达。因此，本研究拟建立人CRC的L-OHP耐药细胞模型，并初步探讨HOXB8在耐药细胞株的表达是否存在差异，为进一步探索L-OHP的耐药机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人CRC细胞HCT-8(上海吉凯基因化学技术有限公司)；1640培养液(美国Gibco公司)；标准胎牛血清(厦门鹭隆生物工程材料有限公司)；TRIzol、cDNA合成试剂盒(美国Invitrogen公司)；噻唑蓝(MTT，中国上海华舜生物工程有限公司)；AnnexinⅤ-cy5凋亡和周期检测试剂盒(美国BD Pharmingen公司)；qPCR扩增试剂盒(上海诺伦生物医药技术有限公司)，PCR各引物由上海生工生物公司合成；兔抗人多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)、核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross completion gene 1, ERCC1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、谷胱甘肽-巯基-转移酶-π(glutathione-s-transferase-π, GST-π)及HOXB8单克隆抗体(美国Abcam公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及HCT-8/L-OHP的建立 癌细胞株HCT-8培养于含10%胎牛血清的1640完全培养液中。取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×105 mL-1，加入终浓度为2 μmol/L(约1/3 IC50)的L-OHP培养液连续作用48 h，弃上清液，加入不含L-OHP的新鲜培养液继续培养，待细胞恢复正常生长后，消化传代，复用2 μmol/L的L-OHP溶液连续作用48 h。重复上述步骤，一个浓度反复3～4次，如此反复换液、传代，逐步提高L-OHP的浓度至20 μmol/L，最终获得能耐受20 μmol/L L-OHP的细胞株，并将其维持培养在含10 μmol/L L-OHP的完全培养液中，建立人CRC耐药细胞株HCT-8/L-OHP，直至细胞可在含10 μmol/L的 L-OHP培养液中稳定生长。对应的野生细胞进行同样的传代，但不加药处理。

根据省耕地质量监测实施方案的要求，坚持“四统一”原则进行耕地质量监测点的建设。监测点选择在生产管理方法及水平与当地大面积生产相同或相似的地方，省级监测点设4个处理小区，即：长期无肥区、当季无肥区、常规施肥区、测土配方施肥区。常规施肥区面积不小于333.4 m2，长期无肥区、当年无肥区、测土配方施肥区面积为66.7 m2。长期无肥区和测土施肥区用水泥做成永久性隔离小区，小区进水口位于进水渠上游。其余小区用塑料薄膜嵌入地下做成防渗漏的田埂来隔离。当年无肥区在监测点田块内活动轮换，5年以上轮换一次[1]。

1.2.6.2 Western-blot检测 细胞加入裂解液RIPA(100 μL/106个细胞)和1 μL蛋白酶抑制物PMSF，吹打冰浴30 min，4 ℃高速离心15 min，收集上清液。以20～40 μg蛋白上样量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗3次，每次10 min。分别加入ERCC1，ABCB1，ABCC1，GST-π及HOXB8一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入羊抗鼠或羊抗兔二抗，室温孵育2 h。用Bio-Rad凝胶成像仪显影。

1.2.3 细胞形态学观察 (1)光镜观察：收集HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞,接种至内铺小玻片的24孔培养板内，培养72 h后，光镜下观察、拍照。(2)透射电镜观察：收集HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，用2.5%戊二醛固定，继续用2%四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色，透射电镜观察、拍照。

通常情况下，关于带电粒子的初速度方向与电场线平行的这类问题的考察点无非就是在q、E、m、a这几个物理量中给定其三，让你求其一，或者给出荷质比。同样，根据上述的动能定理即结合给定条件可求得解题所需要的物理量。

[26] Howard J. Shatz, US International Economic Strategy in a Turbulent World, RAND Corporation 2016, pp. 102-104.

1.2.4 细胞群体倍增时间和细胞生长曲线测定 取对数生长期的HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，消化离心，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 mL-1。取2 mL细胞悬液接种至25 mL培养瓶内。自第1天开始用台盼蓝拒染法，以血球计数板进行活细胞计数，每日取3瓶细胞，计算均值，连续观察7 d。调整2种细胞浓度为5×103 mL-1，接种8块96孔板，每孔200 μL(1×103)，各设6个平行孔，每天用MTT法测2种细胞的吸光值。以培养时间为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

2.1 耐药细胞系构建成功鉴定

1.2.6 检测HCT-8及HCT-8/L-OHP细胞株ERCC1，ABCB1，ABCC1，GST-π及HOXB8基因的表达

1.2.6.1 qPCR检测 TRIzol法提取各组总RNA，取1 μg RNA反转录为cDNA，反转录条件为：42 ℃ 60 min→70 ℃ 5 min。产物进行荧光定量PCR扩增，反应条件如下：94 ℃ 2 min，1个循环；94 ℃ 15 s→62 ℃ 40 s，40个循环。采用ΔΔCt相对定量法分析结果，差异水平用2-ΔΔCt表示。

ΔΔCt=实验组(Ct目的基因-Ct管家基因)-对照组(Ct目的基因-Ct管家基因)

将干馏污水处理后回用于油页岩干馏生产，不仅实现了污水的零排放，每年节约水资源300余万t，而且还可以回收干馏污水余热供暖约11万m2，每年可节约标煤3 019 t。

GAPDH(Human)：

F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′

R:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′

江苏是一个经济大省，又是一个水利大省。江苏的经济社会现代化发展，不仅需要水利提供更高标准的防洪安全保障，还需要提高水资源和水生态环境的基础支撑，以水利的现代化支撑和保障经济社会的现代化发展。

ABCC1(MRP or MRP1)：

F:5′-ATCTTGGTCACGCACAGCAT-3′

R:5′-GCATAGGTACGCAGGAACTCA-3′

ABCB1(P-gp)：

F:5′-AACACCACTGGAGCATTGACTAC-3′

R:5′-ATTACAGCAAGCCTGGAACCTAT-3′

GSTP1：

F:5′-ACCGTGGTCTATTTCCCAGTTC-3′

2.1.2 HCT-8及HCT-8/L-OHP的细胞形态

R:5′-AGGTGACGCAGGATGGTATTG-3′

ERCC1：

R:5′-TCCGCTGGTTTCTGCTCATAG-3′

F:5′-TTTGGCGACGTAATTCCCG-3′

HOBX8：

F:5′-CAGACCTACAGCCGCTACCA-3′

部分出露型孤石的受力情况如图9所示，计算的假定与完全出露型孤石基本相同，只是部分出露的孤石四周与周边土体之间的接触界面存在挤压作用力。

在计算二阶邻近距离时，首先要为每个数据点生成长度为K的邻居列表Oi。Oi通过在高维空间数据上构建vantage-point树并在树上进行最近邻居搜索生成，时间复杂度为O（N log N）。BH-SNE中的参数perplexity（ρ）决定了算法近似程度，在ST-SNE中规定邻居列表长度K=3ρ。根据数据集的不同，ρ的典型值为10-100，故邻居列表Oi的长度一般为30-300。这将后续计算数据点间距离的时间复杂度由 O（N2）降为了 O（KN），同时可以得到可靠的降维结果。当所有数据点的邻居列表Oi生成完毕后，即可根据式（8）计算数据点间的二阶邻近距离。

R:5′-CGCCGCTTACGAGTCAGATA-3′

红腰带还在，那个结还在，只是经风雨剥蚀，早已经不再鲜艳了。望着它，风影有一种想哭的感觉，他呆呆地站了一会儿，便垂头丧气地往回走了。他一边悻悻然地走着，一边想着心事，想着红琴到底怎么样了，还有，父母亲又怎么样了。回到寺院，风影就向师父提出要回家去看看父母，师父很爽快地给了他三天假，风影喜出望外，跪倒在地，朝师父连磕了三个头。风影立即告别师父，化作了一阵风，直奔家里。

1.2.2 MTT法检测各种抗癌药的细胞毒作用 取对数生长期的HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，消化离心后调整细胞浓度为5×104 mL-1。每孔100 μL细胞悬液接种于96孔培养板。培养24 h后，加入倍比稀释成5种浓度的各种抗癌药物[L-OHP，5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(CPT-11)、顺铂(CDDP)及长春新碱(VCR)]各20 μL，每一浓度重复5孔，并设置空白对照和隐形对照组。培养48 h后，吸去上清液，每孔加无血清培养液200 μL及5 mg/mL的MTT 20 μL，继续培养4 h，吸去上清液，每孔加100 μL的DMSO，置于微量振荡器上振荡5 min，在570 nm波长处计算各组的IC50。

显然，对联通来说，无论移动采取什么策略，联通只要采取不涨价策略都可以获得更优的支付。对于移动来说，无论联通采取什么策略，移动只要采取不涨价策略都可以获得更优的支付。这样不涨价就是两个公司的占优策略，所以两家公司都会采取不涨价策略，各获得50的支付(50,50)。当该博弈处于(不涨价，不涨价)策略组合时，联通和移动都无法通过改变自己的策略来获得更好的支付，于是博弈到达纳什均衡状态。

2.1.2.2 透射电镜观察 HCT-8细胞核清晰，形态不规则，核仁明显，核内可见较多的常染色质，未见异染色质；线粒体丰富，其结构及板块嵴清楚完整，细胞表面微绒毛比较丰富。耐药株细胞核大，多见核畸型，染色质增多，少量异染色质，胞质内出现脂滴，线粒体出现肿胀、空泡，粗面内质网扩张，细胞表面微绒毛减少、变短(图2)。

2 结 果

1.2.5 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)分析细胞周期分布及细胞凋亡情况 收集HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，加入-20 ℃预冷的70%乙醇，固定1 h。将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4 ℃下放置30 min。以激发波长为488 nm测定，并用ModFit LT2.0软件分析细胞周期分布。取HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞，均予以20 μmol/L的L-OHP培养液作用48 h，收集培养液以及细胞，根据试剂盒说明书的操作步骤加入凋亡检测试剂，检测细胞凋亡情况。

2.1.1 成功建立人CRC多药耐药细胞株HCT-8/L-OHP 培养7月后，获得生长良好的、能耐受20 μmol/L L-OHP的耐药细胞株HCT-8/L-OHP，可在含10 μmol/L L-OHP的培养液中稳定生长。MTT法检测结果显示，亲本株对L-OHP的IC50值为5.78 μmol/L，耐药株的IC50为62.33 μmol/L、RI为10.78。使用未加L-OHP的培养基培养1月后，测得耐药株的IC50为56.41 μmol/L，RI为9.75。将HCT-8/L-OHP细胞冻存，3月后经细胞复苏，仍能稳定增殖和生长，IC50为58.21 μmol/L，RI为10.07，耐药性基本保持不变。HCT-8/L-OHP细胞不仅对L-OHP产生耐药性，而且对另外4种临床常用的抗癌药物(5-FU，CPT-11，CDDP及VCR)也产生不同程度的耐药性，具有多药耐药特征(表1)。

在我国当前的煤矿建设和生产中，为了将整体的煤矿工程建设生产能力提升上来，在进行煤矿工程的建设中都已经将轨道运输建设到了煤矿矿井内部，借助煤矿轨道运输体系的运行，全面提升了煤矿生产运行效率。但是由于在轨道运输中需要对轨道运输状况进行监督，以此提升轨道监督控制效果。实践证明通过智能综合监控系统应用能够实现对整个煤矿轨道运输监控，对于提升煤矿生产运行效率具有重要性保障。本文以煤矿轨道运输智能综合监控系统设计与应用为研究对象，结合冀中能源股份有限公司东庞矿系统设计应用概况进行了分析，对于提升该煤矿轨道运输能力具有重要性研究意义。

[15] Boleslaw A. Boczek, “International Protection of the Baltic Sea Environment Against Pollution: A study in Marine Regionalism,” The American Journal of International Law, Vol. 72, No. 4 (October 1978), pp. 782-814.

表1 HCT-8/L-OHP细胞的多药耐药检测

Tab 1 The multidrug RI of HCT-8 and HCT-8/L-OHP mg·L-1

抗癌药物HCT-8HCT-8/L-OHPRI5-FU296．451587．225．35CPT-1112．4540．213．23CDDP15．3319．561．28VCR0．442．926．64

FU：5-氟尿嘧啶； CPT-11：伊立替康； CDDP：顺铂； VCR：长春新碱.

当输电线路在广州、惠州、东莞和深圳等地区走线时，沿线建筑物密集，加之高度城市化，土地资源稀缺，架空输电线路走廊与土地资源的矛盾非常突出。在这些地区，将直流线路与接地极线路共塔架设为最佳选择，可以节约一个输电走廊，降低拆迁赔偿费用，降低工程建设难度。

2.1.2.1 光镜观察 HCT-8细胞贴壁生长，呈上皮样单层排列，细胞大小一致，为圆形或椭圆形，边界清楚，胞核大而圆，颜色深，胞质内含颗粒；HCT-8/L-OHP细胞也呈上皮样单层排列，但形态发生明显改变，细胞大小不均，细胞变大，多呈梭形，部分细胞变圆，折光性变强，核大、色深、不规则(图1)。

A：HCT-8细胞(×100)；B：HCT-8细胞(×200)；C：HCT-8/L-OHP细胞(×100)；D：HCT-8/L-OHP细胞(×200). HCT-8细胞大小一致，边界清楚；HCT-8/L-OHP细胞大小不均，呈梭形，折光性变强，核大、色深、不规则. 图1 HCT-8和HCT-8/L-OHP光镜观察 Fig 1 HCT-8 and HCT-8/L-OHP in light microscope

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料采用或中位数表示，并用t检验、秩和检验进行统计学分析；计数资料采用率(或构成比)表示，采用卡方检验进行统计学分析。检验水准α设定为0.05。

2.1.3 细胞生长曲线的绘制和细胞群体倍增时间的检测 通过MTT实验绘制生长曲线，HCT-8细胞：y=0.176 3x-0.052 8，R2=0.990 8；HCT-8/L-OHP细胞：y=0.056 1x+0.082 1，R2=0.984 4。耐药细胞增殖减慢；群体倍增时间HCT-8和HCT-8/L-OHP分别为28.76和64.57 h(图3)。

A：HCT-8细胞(×16 300)； B：HCT-8/L-OHP(×28 000). HCT-8细胞核清晰，未见异染色质；HCT-8/L-OHP核大，多见核畸型，染色质增多，少量异染色质. 图2 HCT-8和HCT-8/L-OHP透射电镜观察 Fig 2 HCT-8 and HCT-8/L-OHP in electron microscope

HCT-8/L-OHP细胞增殖较HCT-8减慢，群体倍增时间延长. 图3 HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞的生长曲线 Fig 3 The growth curve of HCT-8 and HCT-8/L-OHP

2.1.4 细胞周期分布和凋亡检测

我小时候常吃芋艿、土豆、慈姑和山药，今天仍然爱吃这些东西。每次上饭店，总要问一下有没有葱油芋艿。去年我去日本看望刚出生的小外孙，亲家带来的一盒芋艿几乎全让我一个人吃了个精光。

2.1.4.1 细胞周期分布 细胞周期分布分析显示，HCT-8/L-OHP细胞在G2/M期所占比例(18.97%)较HCT-8细胞(4.48%)增多(P<0.01)，同时在S期(26.43%)及G0/G1期(64.33%)所占比例减少，与HCT-8细胞比较，差别具有统计学意义(P<0.01)。

2.1.4.2 细胞凋亡检测结果 凋亡情况检测结果显示，HCT-8/L-OHP细胞早期和晚期凋亡合计约43.47%，而HCT-8细胞的凋亡率约75.47%。提示耐药株的凋亡率明显低于亲本株，二者差别有统计学意义(P<0.01，图4)。

Tube001为HCT-8，Tube004为HCT-8/L-OHP. 图4 HCT-8和HCT-8/L-OHP细胞凋亡情况 Fig 4 The apoptosis of HCT-8 and HCT-8/L-OHP

2.2 HOXB8以及ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1，ERCC1的mRNA表达情况 耐药株HCT-8/L-OHP的ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，ERCC1及HOXB8的mRNA表达均上调，与亲本株HCT-8比较，差别具有统计学意义(P<0.05，表2，图5)；而GSTP1 mRNA的表达二者间差别无统计学意义(P>0.05)。

表2 各基因mRNA的相对表达量

Tab 2 The relative of indicate gene mRNA expression

基因HCT-8HCT-8/L-OHPABCC1(MRPorMRP1)0．997±0．0061．155±0．047☆ABCB1(P-gp)0．952±0．0403．283±0．026☆☆GSTP10．986±0．0320．927±0．066ERCC10．980±0．0122．445±0．062☆☆HOXB80．957±0．0371．407±0．026☆☆

与HCT-8细胞株比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

与HCT-8细胞株比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01. 图5 各基因mRNA的相对表达量 Fig 5 The relative of indicate gene mRNA expression

2.3 HOXB8，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1蛋白表达情况 Western-blot检测结果显示，HCT-8/L-OHP细胞的HOXB8，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1蛋白均呈现相对高表达，与HCT-8细胞比较，差别具有统计学意义(P<0.01，图6)。

图6 各基因蛋白表达结果 Fig 6 The Western-blot analysis of indicate gend

3 讨 论

CRC是临床最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例数达94.5万例，每年有近50万人死于CRC[3]。根据2017年NCCN指南，mCRC患者的标准治疗为姑息化疗，其中含L-OHP的FOLFOX及CAPOX方案为一线化疗方案，可获得近50%的缓解率[7]，但仍有近一半的患者对化疗不敏感，且绝大部分初期化疗敏感的患者终因肿瘤获得性耐药导致化疗失败。因此，寻找肿瘤细胞对化疗药物抵抗的靶点，探索肿瘤细胞对化疗抵抗的机制是克服肿瘤细胞耐药性、提高化疗药物疗效的关键。成功构建能够稳定耐药的细胞系是研究耐药的产生、预防和逆转的重要研究模型[8-10]。

目前，常见的建立耐药细胞株方法有以下2种：采用递增药物浓度持续作用和恒定药物浓度周期作用来进行诱导。研究显示，前者比后者诱导细胞耐药性更强且更稳定[11]。本研究采用前者建立耐药细胞株，结果发现，耐药细胞的形态发生明显改变，细胞代谢率降低，生物活力减弱，群体倍增时间是亲本细胞株的2.25倍，说明耐药细胞株增殖速度减慢，与张立阳等的研究结果类似[12]。随着肿瘤细胞倍增时间的延长，细胞对化疗药物的敏感性降低[13]。从细胞周期的分布发现，耐药株细胞在G2/M期所占比例增多，提示细胞发生G2/M期阻滞，这与其他研究者所建立的耐药细胞株结果相似[14]。另外，细胞凋亡检测发现，耐药细胞株在相同浓度的L-OHP作用下凋亡率更低，进一步佐证了耐药细胞株对L-OHP有更强的抵抗作用。耐药细胞株不仅对L-OHP有抗性，对5-FU，CPT-11，CDDP及VCR也具有一定抗性，产生多药耐药。研究显示，5-FU及CPT-11在CRC患者体内的血药浓度常维持在30和10 μg/L左右[15-16]。本研究中耐药细胞株对5-FU及CPT-11相对耐药可达1 587.22和40.21 μg/L，可见本研究所建立的耐药细胞株可抵抗临床用药浓度。

肠癌细胞对L-OHP的抵抗可能与DNA损伤修复系统的过表达以及蛋白质差异表达相关，其中核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)过表达、膜转运体蛋白过表达以及GST-π过表达等可能通过其调控的基因及其下游事件发挥相应作用[17-19]。本研究还发现，在耐药细胞株中，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1等常见耐药基因表达呈现显著性的差异上调。由于在产生对L-OHP耐药的同时，上述机制的表达异常引起耐药细胞株对其他药物产生抵抗，本研究也证实了该结果。

HOX基因家族是动物胚胎发育过程中的主控基因，目前有较多的研究证实，HOX基因表达异常与肿瘤的发生发展有关[20-23]。HOXB8基因是HOX 基因家族的成员之一，位于17p21.3，编码同源框DNA结合域的核蛋白，参与细胞的正常分化、发育。兰鸿波等研究显示，HOXB8的过表达与肿瘤的发生发展呈现正相关，并可能通过miR-196调控，miR-196可能与AKT通路的激活相关[24-25]。Ding等研究也显示，HOXB8的过表达可能与胃癌的发生发展以及转移侵袭能力呈正相关[26]。本课题组在评估接受含L-OHP方案的CRC患者的疗效时发现，在响应与不响应组中，HOXB8基因呈现显著的差异表达[5]。本研究成功构建L-OHP耐药细胞株，并通过qPCR以及Western-blot揭示了HOXB8基因在耐药细胞株呈现明显差异表达。进一步证实了HOXB8的过表达可能与L-OHP耐药相关，但尚未明确HOXB8通过何种方式调控耐药的产生。

本研究成功构建了L-OHP耐药细胞株，发现其与耐药蛋白的过表达、DNA修复系统的过表达以及GST-π过表达相关，并发现HOXB8基因在耐药株中呈现过表达，但其参与耐药机制尚需进一步研究。

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