慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease，CGD)是一种罕见的原发性免疫缺陷病，是因编码NADPH氧化酶的基因缺陷引起。CGD的遗传方式有X连锁隐性遗传(XR-CGD)及常染色体隐性遗传(AR-CGD)等，其中X连锁隐性遗传更为常见[1]。XR-CGD是由编码NADPH氧化酶的蛋白亚基gp91phox的CYBB基因突变引起[2-4]。2015年7月15日，笔者医院收治1例临床表现为反复感染，入院24 h内迅速死亡的患者，采用二代测序方法进行全外显子测序分析，对患者及家属进行Sanger测序验证，发现该患者携带CYBB基因上一个错义突变(c.949T>A, p.M312K)，为半合子突变，确诊为XR-CGD，报道如下。

1 病例介绍

1.1 临床资料 患者，男性，1岁3月，以“发热10余天”为主诉入院。患者入院前10余天无明显诱因出现发热，经退热抗感染治疗无效，伴精神差、纳差。出生后正常接种卡介苗。患儿2月大时出现左腋下淋巴结肿大，生后多次反复发热，反复发生肛周脓肿及头皮疖肿。入院查体：体温36.0 ℃，脉搏116 min-1，呼吸32 min-1，血压120/68 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，动脉血氧饱和度(arterial oxygen saturation，SaO2)96%。面色苍白，精神差，全身皮肤散在陈旧性皮疹，部分有结痂，左腋下可及一肿大淋巴结，大小约4 cm×5 cm，边界清楚，无触痛，余浅表淋巴结未触及肿大。咽充血，咽后壁可见一溃疡，未见分泌物。颈软。双肺呼吸音粗，未闻及干、湿啰音。心音有力，律齐，心前区闻及Ⅱ/Ⅵ收缩期杂音。腹稍胀，肝肋下4～5 cm可及肿大，脾肋下未触及肿大，肠鸣音4 min-1，肛周及外阴皮肤潮红，未见破损。病理征阴性，CRT 1 s。入院后患儿生命征不稳定，出现休克症状，予扩容补液、抗感染、呼吸机辅助通气，予血管活性药物、输注血液制品、镇静等对症处理。后患儿出现心跳骤停，经抢救无效于2015-07-16死亡。

1.2 二代测序 在知情同意的前提下，采集患者及其家属全血各2 mL(EDTA抗凝血)，使用血液基因组中量提取试剂盒(Blood Gen Midi Kit，中国CWBIO公司)提取全基因组DNA。参考文献及OMIM数据库、NCBI数据库的信息，将人类已知的全部(约2万个)基因的基因组外显子区域定制罗氏Nimble Gen捕获探针，进行全外显子捕获。合格的基因组DNA被Cavoris仪随机打断至200 bp左右，片段化DNA在Klenow Fragment、T4 DNA polymerase和T4PNK的作用下进行末端补平修复。在聚合酶体系下，使上一步得到的修复产物在3′末端加上A碱基，最后在两端加上接头。加上接头后的连接产物经4～6轮LM-PCR扩增，将文库与探针杂交60～68 h，使用链霉素磁珠进行洗脱，洗脱产物经10轮LM-PCR扩增。PCR产物在Illumina hiseq2500平台标准化上机测序，测序数据利用Illumina的软件进行分析处理。参考序列为hg19基因组。根据测序深度及突变质量，对检测到的变异进行过滤筛选，依据1000Genomes Project，Exome Variant Server (EVS)及Exome Aggregation Consortium (ExAC)数据库，滤除人群中突变频率>1%的变异，去除内含子变异、同义变异(除外位于剪切位点的变异)等，筛选出可能致病的变异，同时使用SIFT等软件对筛选出的突变对蛋白功能的影响进行预测。结合患儿的临床表现及遗传方式，得到可能致病的突变。

(1)钢渣资源化利用可以分为钢铁工序再利用、环境治理(土壤改良、水处理和大气脱硫等领域)、建材利用(微粉和建材集料等)等方式，结合国外钢渣处置利用的发展经验，建材化利用将是消纳钢渣的重要途径，消纳钢渣规模量也最大，但钢渣稳定性差是制约其建材化利用的主要因素。

1.3 一代测序(Sanger法)验证 根据CYBB基因所验证位点序列设计引物，采用PCR方法进行扩增。PCR扩增产物用ABI 3730XL测序仪测序，基因序列分析采用DNASTAR软件进行序列分析和比对。

因此，绿色针灸的实践和策略对改善中国城市公共空间的问题有相当的借鉴和引导作用。相较于其他的城市针灸类型，绿色针灸着重于创造性地采用绿色植物来塑造和激活城市公共空间，对于大规模、高密度的中国城市有很强的针对性改善作用。合理地安排项目的规模、周期和组织，充分地考虑和利用绿色植物的生理、生态和文化特性，能经济有效而快速灵活地在城市内创造多样化的、物种丰富的、可达性和停留性强的绿色公共空间，对城市整体的活化和健康发展做出持续的贡献。

1.4.1 实验室检查结果 该患儿血液免疫功能相关检查基本正常(表1)。

表1 患儿血液实验室检查相关结果

Tab 1 Laboratory blood tests of this patient

血清学指标患者数据参考值范围白细胞(×109L-1)14．713．5～9．5淋巴细胞(×109L-1)5．31．1～3．2CD3+/%59．361．1～77CD3+CD4+/%47．425．8～41．6CD3+CD8+/%9．818．1～29．6CD19+/%32．97．3～18．2CD3-CD56+16+/%1．58．1～25．6ρIgG/(g·L-1)9．63～10ρIgA/(g·L-1)0．7840．14～1．08ρIgM/(g·L-1)1．650．43～2．39cIgE/(IU·mL-1)1430～100

北京邮电大学等40 所高校发文总量达1825 篇，占所有文章总数的近一半量。北京邮电大学和电子科技大学分别以170 篇和147 篇的数量占据发文量榜首。

1.4 结果

2 讨 论

二代测序方法进行全外显子测序分析，发现患者的CYBB基因第9外显子存在半合子突变，进一步对患者及其家属用Sanger测序法验证该位点的突变情况，证明患者CYBB基因携带一个已知错义突变(c.949T>A, p.M312K)，来源于母亲及外婆(图1)，而其小姨并未携带该突变(参考序列NM-000397.3)。全外显子测序结果还显示，与免疫缺陷性疾病有关的3个基因存在碱基变异(表2)，但后续通过遗传方式及与临床表型的关联程度排除了该3个变异的致病性。

A：患者家系图，其母亲、外祖母均为该突变的携带者；B：患者及其父母、外婆、小姨Sanger测序验证CYBB基因c.949碱基改变. 参考序列NM-000397.3. 图1 患者家系图及测序图谱 Fig 1 Pedigree and Sanger sequencing resultsof the family

表2 二代测序发现的该患者其他基因的位点变异

Tab 2 Summary of variations in other genes related with immunodeficiency disease revealed by whole exome sequencing in this patient

基因染色体位置核酸改变氨基酸改变Rs编号突变类型SELPChr1c．1334G>C(E9)p．445，A>Grs116959152杂合NCF2Chr1c．836G>A(E8)p．279，T>Mrs13306581杂合ZAP70Chr2c．66G>T(E3)p．22，E>D-杂合

CGD是因编码NADPH氧化酶的基因缺陷引起。NADPH氧化酶由5个蛋白亚单位组成：gp91phox，p22phox，p47phox，p67phox，p40phox。其中XR-CGD是最常见的类型，约占CGD病例的60%，是由编码gp91phox蛋白的CYBB基因突变引起[3-4]。CYBB基因位于Xp21.1，该基因长30 kb，包含13个外显子。据HGMD网站报道，截止至2015年12月已发现CYBB基因突变700余种，最常见的突变类型是错义突变。不同的突变引起吞噬细胞gp91phox蛋白功能表达的不同，从而引起氧化酶功能障碍[2]。

CGD是一种罕见的原发性免疫缺陷病，是由吞噬细胞功能缺陷引起的，发病率大约为1/250 000～1/200 000。其主要临床表现是严重的反复的细菌及真菌感染，以及因反复炎症造成的胃肠道、泌尿生殖道等器官的肉芽肿增生。临床诊断主要依靠典型的临床症状、硝基四唑氮蓝(NBT)试验及中性粒细胞呼吸爆发试验等[5-6]，确诊仍需依靠基因检测。本研究中，患者入院时已处于感染导致脓毒血症的状态，后迅速出现休克，于入院第2天抢救无效死亡。结合患者既往多次感染病史，考虑其患有某种免疫缺陷病，患者死亡时免疫功能相关检查(体液免疫及细胞免疫功能)尚未回报，因此在征得患者家属同意的情况下，及时外送基因检测公司进行全外显子测序，最终证实了XR-CGD的诊断。回顾性分析该患者的临床表现，与CGD相符。其主要表现为反复感染，感染部位累及皮肤(头皮、肛周)及肺，同时还有卡介苗接种同侧腋窝淋巴结肿大。实验室检查提示，细胞及体液免疫功能正常。因此，对于临床上有患者出现反复感染，怀疑免疫缺陷，但常规细胞免疫及体液免疫功能却正常的患者，应考虑CGD可能。

这个事件早在之前朋友圈发酵，甚至有人因此怀疑WSET认证的价值是否不如从前。单靠一纸证书是否能够全面地去了解一位从业者的知识能力水平？David Allen MW表示：“WSET 4级是一项非常认真严肃的考试，而且整个课程经过了极大的改进，比25年前的文凭课程要困难得多。如果越来越多的中国人通过WSET Diploma，我认为这并不意味着它没有价值。相反，它支撑着葡萄酒教育，让一些不学无术的人无法在葡萄酒行业中立足。我相信WSET也会采取措施来保持其声望。”

本例患者携带的突变为c.949T>A，引起第312位蛋白质由蛋氨酸变为赖氨酸。该突变由Lee于2008年报道[7]，Lee的研究中携带该突变的患者的临床表现为肺脓肿、肛周脓肿及淋巴结炎，无结核及卡介苗接种并发症。本研究中，患者接种卡介苗的同侧腋窝淋巴结出现明显肿大，余淋巴结未见肿大，但因未行淋巴结活检，未能推测其是否有淋巴结结核或卡介苗感染。Lee等报道，17例患者中有14例患有结核或卡介苗相关并发症，患病率较高[7]。在我国，卡介苗属于计划免疫的部分，一般在生后3 d内接种，所以对于有免疫缺陷病家族史的患儿，避免接种卡介苗可减少结核或卡介苗感染的发病率。目前美国已采用TREC试验对重症联合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)进行筛查[8]，期待未来能针对CGD、SCID等免疫缺陷病开展新生儿筛查。

1.4.2 测序结果 目标区域平均测序深度为66.08，目标区域覆盖度99.7%，89.76%目标区域>10×覆盖度，78.11%目标区域>20×覆盖度。

Roos等还报道过1例CYBB基因第312位蛋白质改变的病例[2]。该患者的947位碱基T被替换为G，从而导致蛋氨酸变为精氨酸，进行蛋白表达及酶学测定后，判定其为x91+型，即gp91phox蛋白表达正常，NADPH氧化酶活性缺失[4]。本病例与该病例相比，同为第949位碱基发生改变，导致312位蛋白质变为精氨酸或赖氨酸，二者均有带正电荷的侧链，同为碱性氨基酸。所以推测c.949T>A(p.M312K)可能也为x91+型，可引起酶活性基本缺失。

近几年，随着二代测序技术的发展，费用降低，测序速度加快，已成为罕见单基因遗传病诊断的重要方法之一。通过二代测序技术，可以快速地对目的基因组合或全外显子进行测序，使得对罕见病、疑难病的诊断变得更加容易[9]。如本例患者，病情进展迅速，入院1 d内即死亡，临床实验室检查尚来不及完善，而通过二代测序技术进行全外显子测序分析，明确诊断，并可对家属提供遗传咨询。由于同时对全外显子进行测序，测序结果可能会提示多个基因携带变异。如本研究全外显子测序结果显示了另外3个与免疫缺陷性疾病有关的基因上存在碱基变异。与SELP基因及NCF2基因相关的疾病为遗传性IgE反应过敏症及遗传CGD细胞色素B阳性2型，均为常染色体显性遗传，但在此2个基因上发现的变异均为NCBI dbSNP数据库中记载的已知SNP位点，其临床意义为良性。因ZAP70突变引起的选择性T细胞缺陷病为常染色体隐性遗传病，该患者携带ZAP70杂合突变，故不会致病。所以全外显子测序检测出的这3个基因变异均无临床意义。这就需要临床医师进行鉴别分析，过滤或剔除无用信息，找到真正的致病突变。

爷爷奶奶照看孙女，因索要“带孙费”，与儿子儿媳对簿公堂，山东淄博市博山区人民法院日前经过审理认为，爷爷奶奶帮儿子媳妇带孙子非法定义务，因此索要“带孙费”的要求合情合理合法，予以支持。

综上所述，对于临床症状不典型，或因不可抗拒原因(如患者死亡)而造成临床资料不完善，无法进行临床诊断时，采用二代测序技术进行目的基因组合或全外显子测序，可以帮助医师明确诊断，并对患者家庭提供可靠的遗传咨询。

参考文献：

[1] Segal B M, Leto T L, Gallin J I, et al. Genetic, biochemical and clinical features of chronic granulomatous disease[J]. Medicine (Baltimore), 2000,79:170-200.

[2] Roos D, De Boer M, Kuribayashi F, et al. Mutations in the X-linked autosomal recessive forms of chronic granulomatous disease[J]. Blood, 1996,87:1663-1681.

[3] Rae J, Newburger P E, Dinauer M C, et al. X-linked chronicgranulomatous disease: Mutations in the CYBB gene encoding the gp91-phox-component of therespiratory burst oxidase[J]. Am J Hum Genet, 1998,62:1320-1331.

[4] Roos D, Kuhns D B, Maddalena A, et al. Hematologically important mutations: X-linked chronic granulomatous disease (third update)[J]. Blood Cells Mol Dis, 2010,45(3):246-265.

[5] Ochs H D, Igo R P. The NBT slide test: a simple screening method for detecting chronic granulomatous disease and femalecarriers[J]. J Pediatr, 1973,83(1):77-82.

[6] Alvarez-Larran A, Toll T, Rives S, et al. Assessment ofneutrophil activation in whole blood by flow cytometry [J].Clin Lab Haematol, 2005,27(1):41-46.

[7] Lee P P, Chan K W, Jiang L, et al. Susceptibility to mycobacterial infections in children with X-linked chronic granulomatous disease[J]. Pediatr Infect Dis J, 2008,27(3):224-230.

[8] Chinn I K, Shearer W T. Severe combined immunodeficiency disorders[J]. Immunol Allergy Clin North Am, 2015,35(4):671-694.

[9] Yu Y, Wu B L, Wu J, et al. Exome and whole-genome sequencing as clinical tests: a transformative practice in molecular diagnostics[J]. Clin Chem, 2012,58(11):1507-1509.