睡眠是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，是维持生命所必须的过程，根据睡眠过程中脑电图、眼球运动情况，睡眠可分为快速眼球运动（rapid eye movement，REM）和非快速眼球运动（non rapideye movement，NREM）两个时相。其中 REM 睡眠亦称异相睡眠（paradoxical sleep），它对于保证学习、记忆和情感等大脑高级功能正常具有非常重要的作用［1］。随着生活节奏的加快和社会竞争的增加，睡眠障碍或睡眠相关疾病的发生率逐年增加，越来越多的人处于慢性睡眠剥夺状态。长期睡眠不足或异相睡眠剥夺（paradoxical sleep deprivation，PSD）严重影响人们的生活质量、身心健康和学习记忆。松郁安神方是黄俊山教授临床上治疗失眠的经验效方，临床上用于治疗失眠疗效显著。前期实验已证实该方能改善REM睡眠剥夺所致的大鼠学习记忆能力下降［2］，本实验进一步通过检测大鼠海马学习记忆的关键蛋白——cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的表达和变化，探讨松郁安神方改善PSD大鼠学习记忆能力的作用机制。

In this study, the direct optical band gap of the samples fabricated at three different substrate temperatures is determined by using Tauc’s equation[5] through UV–vis measurements and by plotting (α v)2 versus photon energy (v) as:

1 材料

1.1 动物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，清洁级，体质量（200±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。动物置于实验环境中饲养3 d，给予充足食物和水。实验前将大鼠随机分为4组：对照组、PSD模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组5只。

1.2 主要药品与试剂 RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq（大连TaKaRa公司）；细胞裂解液、PMSF（碧云天生物技术有限公司）；蛋白 Marker（美国 Thermo 公司）；一抗：CREB及 p-CREB（美国 Cell Signaling Technology公司）；GAPDH（美国 Cell Signaling Technology公司）；二抗：辣根过氧化物酶标记二抗（美国 SAB公司）；显影液（美国Thermo公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。中药松郁安神方由福建省中医药研究院提供。

1.3 主要仪器 睡眠剥夺装置（中国医学科学院药物研究所）；微量紫外分光光度计（美国Thermo公司）；7 500 fast型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；蛋白电泳和电转仪（美国Bio-Rad公司）；Alpha多色荧光、化学发光凝胶成像系统（美国ProteinSimple公司）。

据了解，今后三方将充分发挥各自优势，挖掘自身资源，在国家重大战略和现实需求的指引下，推动植保大数据平台的建设。尤其是要引入人工智能技术，共同打造一个惠及政府政策制定、农作物生产、病虫害监测预警等多个层面的智慧植保平台，让植物保护工作呈现出前所未有的科技化图景。

［4］ 叶晨静，赵忠新.快速眼球运动睡眠剥夺对大鼠学习、记忆能力及其海马组织脑源性神经营养因子表达的影响［J］.第二军医大学学报，2007，28（1）：82-86.

2 方 法

2.1 PSD模型建立 采用改良多平台睡眠剥夺法建立模型［3］。每次取8只大鼠放入睡眠剥夺装置内，内有9个小平台，平台直径6.5 cm，平台周围注满水，平台高出水面约1.0 cm。当大鼠进入异相睡眠时，由于全身肌肉张力降低，出现垂头触水而觉醒，使动物不能进入异相睡眠，连续睡眠剥夺96 h。对照组采用与睡眠剥夺组一样的装置，只是把大鼠放在直径为12.0 cm的大平台上，在大平台上的动物能够进入异相睡眠，使其所处环境与其它组完全一致。2.2 给药方法 睡眠剥夺第1天开始进行灌胃给药。松郁安神方由甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，丹参 15 g，酸枣仁 15 g，首乌藤 30 g，珍珠母30 g，生龙骨30 g，合欢皮 15 g组成，药材加 10倍量的水浸泡30 min，珍珠母和生龙骨先煎30 min后，加入其余中药，先武火煮沸，再文火煮30 min，过滤，残渣加水煎煮，重复2遍，合并滤液，浓缩至所需浓度。中药高剂量组、中药低剂量组分别按34 g／kg、17 g／kg体质量灌胃给药，对照组和PSD模型组均给予等体积蒸馏水，每天1次，共7 d。于第7天灌胃2 h后取材，在冰面上迅速分离海马组织，-80℃冰箱保存。

2.3 实时荧光定量PCR检测 总RNA提取参照试剂盒说明书进行。提取的总RNA纯度及完整性检测后，选用天根Quant cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。在进行RT-PCR实验前，用普通PCR检验引物的特异性，PCR扩增产物用1.7%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq（2×） 10 μL，50×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上下 游 引 物分别 为 1 μL，cDNA 模 板 7.5 μL，加DEPC水补至20 μL。PCR的反应条件为：95℃预变性 30 s，95℃变性 3 s，60℃延伸 30 s，40 个循环。

11月8日，意大利国际葡萄酒学院(Vinitaly International Academy )全球之旅第三站移师香港，30名精选学员跟随新任教员: 葡萄酒大师Sarah Heller和认证“意大利葡萄酒专家”Henry Darvar，于香港国际会展中心北区开启了新一轮理论与品鉴相结合的意大利葡萄酒深度探索。本次课程内容专注于意大利葡萄酒产区、品种、文化、美食理论，并特别定制了4场葡萄酒品鉴，3场特别的Tasting实验室和分组视频演示作业。

2.4 蛋白印迹法检测 取海马研磨，使组织细碎，加入裂解液，置于冰上裂解，匀浆液离心，采用微量紫外分光光度计测定组织总蛋白含量。总蛋白按1∶1加入2×上样缓冲液，混匀，变性处理后进行蛋白印迹法检测，其步骤大致如下：经过灌胶、加样、电泳、转膜后，将膜放入5%脱脂奶粉封闭液置室温摇床上封闭 2 h，加一抗（CREB，兔抗，1∶500；p-CREB，兔抗，1∶500；GAPDH，兔抗，1∶1 000）于 4℃孵育过夜。然后加入辣根过氧化物酶标记（HRP）的二抗（羊抗兔 1∶5 000），二抗室温摇床上孵育 1 h，最后将膜正面朝上放置在显影板上，曝光显影。用AlphaView SA软件分析光密度，根据光密度对蛋白条带进行分析，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白与内参光密度比值。将对照组的光密度比值设定为1，其余各组与对照组的比值作为最后结果进行统计。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料属正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

松郁安神方既能改善大鼠REM睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力［2］，又能够镇静安神，增加睡眠时间和深度，从而改善记忆。本实验结果显示：REM睡眠剥夺96 h后，大鼠海马CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表达均降低，这与之前的研究报道一致。松郁安神方干预后，能明显升高海马CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表达，提示松郁安神方改善大鼠学习记忆能力可能通过调节CREB而发挥作用。但该方是否进一步调控CREB相关的信号通路，还有待于进一步的研究。

图1 4组PSD大鼠海马CREB mRNA表达量比较

图2 4组PSD大鼠海马p-CREB蛋白表达量比较

4 讨 论

CREB是一种关键的核转录因子，在各系统中均发挥着重要的作用，能调节神经可塑性相关基因的表达［6］。很多与睡眠相关的神经递质和调质可影响脑内cAMP的含量［7］。当神经递质与细胞膜上的特异受体结合后，激活腺苷酸环化酶，水解生成第二信使cAMP，cAMP进一步激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），即激活cAMP-PKA信号通路，CREB在神经系统中通常作为许多信号通路的终止与交汇点，其调控的上下游信号分子及其靶基因和CREB一起参与了神经细胞存活、再生、分化等过程，与突触的可塑性和学习记忆等正常生理活动密切相关［6，8］。 研究表明：睡眠剥夺阻碍海马 cAMPPKA信号通路，可扰乱认知过程［9］。对啮齿动物的研究也表明：REM睡眠剥夺能降低海马磷酸化CREB （P-CREB）水平［10］。可见海马中磷酸化 CREB水平与学习记忆关系密切。

学习记忆与睡眠是相互影响的过程，学习记忆能影响睡眠的结构和时间，睡眠也可对觉醒时所获信息进行加工、整理并巩固成长时记忆，其中，异相睡眠与学习记忆关系较大。有研究报道：异相睡眠剥夺对大鼠的学习记忆能力存在一定的损害，其学习和记忆的获得与巩固过程下降［4］；异相期睡眠剥夺可引起大鼠空间参考记忆能力低下［5］。

人们常说，做农资是需要情怀的，这不仅仅是因为农资人常年要忍受风吹日晒、舟车劳顿之苦，更是因为他们深入田间地头，最了解农民的辛苦，他们想要更好的产品推广开来，让农民增产增收。

在异相睡眠期，除眼肌和中耳肌外，其它肌肉尤其是颈后肌和四肢肌肉的张力极度下降，不能维持某种姿势［3］，改良多平台睡眠剥夺法是根据这一原理设计。此外，为了避免水环境对动物造成一定的应激反应，本实验采用大平台进行对照。大平台的直径允许大鼠进入异相睡眠，其他环境均与小平台相同。目前该方法是研究睡眠剥夺较常用且成熟的动物模型建立方案。

3.1 松郁安神方对PSD大鼠海马CREB mRNA表达的影响 实时荧光定量PCR结果显示：连续睡眠剥夺96 h后，大鼠海马CREB mRNA表达明显降低，相对表达量为（0.63±0.10），与对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；不同剂量松郁安神方干预后CREB mRNA表达明显升高，并呈明显的剂量效应，中药高剂量组相对表达量为（0.86±0.09），与模型组比较有统计意义（P＜0.01），中药低剂量组相对表达量为（0.75±0.08），差异也有统计学意义（P＜0.05）。 见图 1。3.2 松郁安神方对PSD大鼠海马CREB蛋白表达的影响 蛋白印迹法结果显示：连续睡眠剥夺96 h后，大鼠海马磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表达降低，相对表达量为（0.63±0.03），与对照组比较，有统计学意义（P＜0.01）；中药高、低剂量组干预后p-CREB表达明显升高，中药高剂量组相对表达量为（0.91±0.03），中药低剂量组相对表达量为（0.78±0.09），与模型组比较，均有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

虽然不懂，但也能理解看直播人的那份激动。有人说：“一切都是青春安排最美好的样子，那是属于我们的青春。”那些付出过时间的东西，我们很难从心底抹去。

参考文献：

［2］ 曾雪爱，黄俊山，王雅丽.松郁安神方对REM睡眠剥夺大鼠认知功能及神经递质的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18（4）：392-393，397.

［1］ 尹贞云，赵忠新.镇静催眠作用药物对失眠患者睡眠结构的影响［J］.中华神经科杂志，2010，43（1）：69-71.

［3］ 黄建欧，赵忠新.大鼠睡眠剥夺方法的研究进展［J］.中华神经医学杂志，2004，3（3）：229-230.

⑧严格资金管理，确保专款专用。在资金管理方面，严格依照《水利部关于加强水利科技专项经费管理的若干意见》和“资金审计制”等一系列规章制度，设立专户、对“948”项目资金进行管理，拨付项目引进资金必须与项目的进度、项目合同的要求相一致。

［5］ 张微胜，侯一平，王德贵，等.异相睡眠剥夺对大鼠空间学习记忆的影响［J］.中国行为医学科学.2004，13（5）：496-498.

［6］ HEYWARD P．Presenilin dysfunction leads to memory and plasticit defects ［J］．Lancet Neurol，2004，3（6）：327．

［7］ 朱国庆，张惠秀，王敏，等.中枢应用外源性cAMP和ATP对大鼠睡眠的影响［J］. 中国应用生理学杂志，1993，9（2）：189-190.

［8］ LONZE B E，GINTY D D.Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system ［J］.Neuron，2002，35（4）：605-623.

对致密块状矿体，当其与围岩边界明显时，应注意界面影响，有时可能会因界面积累电荷的影响使得观测常常出现反常现象。当矿体露头致密到面极化程度时，不宜用对称小四极法在露头上获得极化率，应改用其它方法测量。

［9］ LUO J，PHAN T X，YANG Y，et al.Increases in cAMP，MAPK activity，and CREB phosphorylation during REM sleep：implications for REM sleep and memory consolidation ［J］.J Neurosci，2013，33（15）：6460-6468.

［10］ ALHAIDER I A，ALEISA A M，TRAN T T，et al.Sleep deprivation prevents stimulation-induced increases of levels of P-CREB and BDNF：protection by caffeine ［J］.Molecular and Cellular Neuroscience，2011，46（4）：742-751.