硬化病（systemic sclerosis，SSc）是以损害皮肤甚或多个器官、系统的炎性纤维化、小血管病变为主要特点的慢性、进行性自身免疫性疾病［1］，其发病机制尚不明确。近年研究发现：β-catenin作为促纤维化通路——Wnt／β-Catenin信号通路中重要的枢纽因子，在SSc的发病过程中可能发挥着潜在的重要作用［2-5］。我们认为SSc可归属中医“痹症”范畴，其病机之根本在于邪气痹阻经脉。气血不足，脾肾阳虚，温煦不能是其发病的内在基础；外感风、寒、湿等邪气，内生湿、痰、瘀是其条件；且与情志刺激，饮食不节等密切相关。加味阳和汤是由《外科证治全生集》中阳和汤化裁而来，其治疗硬皮病的临床疗效确切［6］。本实验通过加味阳和汤治疗硬皮病小鼠模型，观察小鼠皮肤中β-catenin治疗前后表达水平变化，来探讨其可能的机理。

1 材料与方法

1.1 动物 40只健康BALB／C小鼠，SPF级，雌性，6周龄，体质量（20±2）g，购于上海市西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级实验室中，标准饲料、单笼4只饲养小鼠，明暗周期为12 h，自由取食和饮水。

1.2 药物 采用加味阳和汤（《外科证治全生集》），组成：熟地黄 30 g，鹿角胶 6 g，干姜 6 g，桂枝 6 g，麻黄 9 g，白芥子 9 g，金银花 15 g，玄参 15 g，当归7 g，龟甲6 g，甘草3 g。水煎煮后过滤，浓缩至流浸膏，乙醇醇提，滤过，回收乙醇，最终滤液加水调至含生药量1.12 g／mL，分装灭菌，购自福建省第三人民医院。注射用盐酸博来霉素（BLM，日本化药株式会社）溶于高压灭菌的生理盐水中，配制成最终浓度为500 μg／mL。醋酸地塞米松片（福州市海王福药制药公司）溶于生理盐水将其配制成浓度为0.2 mg／mL醋酸地塞米松混悬液。

1.3 主要试剂及仪器 β-actin抗体（美国Sigma公司，批号：SAB1305567）；β-catenin 抗体（美国 CST公司，批号：#9562）；P-β-catenin 抗体（美国 CST 公司，批号：#9561）；Trizol总 RNA 提取液、逆转录试剂盒、qPCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗小鼠多克隆抗体、二抗HRP标记山羊抗兔IgG（美国CST公司）。

1.4 模型制备及给药 40只雌性BALB／c小鼠背部中央区被毛剃除，随机分为正常组、空白组各8只，造模组24只。第1～4周，空白组予背部皮下注射生理盐水0.1 mL，造模组予背部皮下注射浓度为500 μg／mL 的博莱霉素 0.1 mL／d 制备硬皮病模型，正常组不注射，连续4周。造模成功后造模组随机分为模型组、阳和汤组、地塞米松组各8只。第5～8周行药物干预治疗，各组用药剂量均按临床等效量灌胃，即小鼠（体质量20 g）使用醋酸地塞米松片剂量为0.04 mg／d，加味阳和汤剂量为22.4 mg／d。灌胃前用蒸馏水将备用药物稀释成相应浓度。阳和汤组予加味阳和汤、地塞米松组予地塞米松灌胃处理，正常组、空白组和模型组予等容量生理盐水灌胃，0.2 mL／20 g，1 次 ／d。

参考文献：

“凡事预则立，不预则废”，在建筑施工阶段，施工单位的技术人员需要把握整体布局，进行科学合理规划，结合实际智能系统的使用需求，仔细分析潜在的影响因素。例如，在智能建筑系统施工过程中，应提前对智能系统使用过程中可能出现的问题做好防备措施，并对工程完成情况进行验收，保证每一道工序的质量，此外，应安全保存工程每个过程的检查和验收数据，在相关管理人员确认签字后，施工技术人员才能进行下一道工序的施工，将整个过程的监管工作落到实处。工程施工过程中不能违反施工规律，应确保建筑的稳定性和便捷性，减少施工投资，提高经济效益。

2 指标检测

2.1 皮肤组织HE染色 ①将已包埋的组织蜡块用切片机切成4 μm的薄片，贴附在防脱载玻片上，60℃恒温箱中烘干1 h；② 二甲苯脱蜡2道，每道各5 min；③ 依次用 100%-100%-95%-90%-80%-70%乙醇脱蜡至水，时间分别为3-3-2-2-2-2 min，蒸馏水冲洗、浸泡；④ 苏木素浸染 7 min，流水冲洗；⑤ 1%盐酸乙醇分色6 s，流水下稍冲洗；⑥ 伊红染液复染约5 min，流水冲洗；⑦ 依次用70%-80%-90%-95%-100%-100%乙醇脱水，时间分别为15 s-15 s-15s-30 s-2 min-2 min；⑧ 二甲苯透明2道，每道3 min；⑨ 放在专用通风橱吹干后，给予中性树胶进行封片，而后在显微镜下拍照。

复杂的菌类植物在潮湿的环境下野蛮生长。它们冒头在林地表面，看起来不起眼，却吸引了大量户外摄影师的目光。

2.2 实时荧光定量PCR检测（quantitative real-time PCR，qPCR） 取皮肤组织100 mg，用液氮研碎后加入1 mL Trizol总RNA提取液，提取小鼠皮肤组织总RNA，蛋白核酸分析仪测定RNA浓度，甲醇变性电泳鉴定RNA完整性。参照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA。荧光定量PCR扩增目的基因，引物序列如下：

表1 引物序列表

指标β-catenin GAPDH上游引物序列5'-GTTCTACGCCATCACGACACTG-3'5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'下游引物序列5'-GAGCAGACAGACAGCACCTTCA-3'5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'

图1 各组小鼠皮肤组织HE染色图（×400）

PCR扩增目的基因参照qPCR试剂盒，采用两步法PCR扩增标准程序：① 预变性，95℃ 10 s；②PCR反应40个循环，95℃ 5 s，60℃ 30 s；③ 解离。根据反应结果读取数值，计算2^-△△CT值，分析统计结果。

2.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测 皮肤组织剪碎后置于匀浆器中，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂 PMSF（100∶1），4℃裂解 30 min，高速离心后取上清液，按照BCA试剂盒说明书测蛋白浓度，再加入适量蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min变性蛋白，分装后-80℃保存。10%SDS-PAGE凝胶电泳后转印蛋白到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗兔多克隆β-Catenin（1∶1000） 4℃孵育过夜，37℃摇床下孵育二抗 2 h。 β-actin（1∶3000）作为内参。

1.教学共同体彰显内涵特色。归根到底，创新创业教育是一种教育。在实行教育的时候要充分尊重学生的主观需求，无论是在课程安排还是教学内容方面都要契合学生的发展需要，严格调研和论证相关制度安排，建构彰显内涵特色的教学共同体［6］。

3 结果

3.1 皮肤组织HE染色结果 治疗后与正常组比较：空白组无明显差异；模型组可见真皮层增厚，排列紊乱，皮下脂肪层变薄；阳和汤组真皮层稍变薄，胶原纤维束排列较疏松，皮下脂肪层稍变薄；地塞米松组真皮层胶原纤维增生情况改善，毛囊萎缩情况有所好转。见图1。

本病例中，27根管入口急弯，采用去除牙本质壁，消除根管入口急弯的方法，但在去除牙本质时应避免侧穿、底穿的发生。预备MB2时应注意[7]：①先用 #8、#10锉配合EDTA凝胶疏通根管；②根据根管弯曲度预弯器械；③扩大根管口和根管上2/3；④结合运用化学预备、X线辅助、根管显微镜等多种手段。

有研究发现Wnt／β-Catenin信号能诱导SSc纤维化［7］。TGF-β信号是纤维化的核心通路，是病理性成纤维细胞激活和胶原过度释放的主要驱动者［8］。TGF-β信号和 Wnt／β-Catenin信号之间存在交互作用，在SSc病变组织中，TGF-β信号还能够促进在纤维化过程中具有重要作用的p300的表达［9］，进而调控β-Catenin的表达。β-Catenin活化后可使成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，过度合成细胞外基质，引起SSc皮肤纤维化。

3.3 各组小鼠皮肤组织β-Catenin蛋白表达水平见图 2、表 3。

4 讨论

中医没有确切的病名与硬皮病对应，课题组认为硬皮病可归属中医“痹症”范畴，其病机之根本在于邪气痹阻经脉。课题组在临床上审证求因，在结合硬皮病患者个体情况辨证分析的同时，把握病变机理，认为患者正气不足，脾肾阳虚，或内有沉寒痼冷，或卫外不固，风寒湿之邪，留滞不去，传舍于经络，外凝于肌表腠理，使全身皮肤顽硬（体表微循环障碍），内舍于脏腑（脏腑微循环障碍），甚至危及生命。笔者根据多年临床经验，总结本病多数患者伴有畏寒肢凉，肢端青紫苍白、僵硬、肿胀，大便溏薄稀，舌淡嫩，苔白，脉沉细或弦涩，一派阳虚血瘀硬化性皮损以及脏腑纤维化征象，临床上在加味阳和汤基础上，予辛药、藤药、虫药直接通络，通补兼施，持久缓图，修复既有病理损伤。

表2 各组小鼠皮肤组织β-Catenin mRNA表达水平（x±s）

注：与模型组比较，1） P＜0.05；与正常组比较，2） P＜0.05。

β-Catenin 1.00±0.031）1.03±0.011）4.37±0.252）1.45±0.061）2）2.04±0.141）2）组别正常组空白组模型组阳和汤组地塞米松组只数8 8 8 8 8

图2 各组小鼠皮肤组织β-Catenin蛋白表达

表3 各组小鼠皮肤组织β-Catenin、P-β-Catenin 的蛋白表达量（x±s）

注：与模型组比较，1） P＜0.05；与正常组比较，2） P＜0.05。

β-Catenin 0.37±0.021）0.36±0.041）0.72±0.052）0.46±0.011）2）0.35±0.031）组别正常组空白组模型组阳和汤组地塞米松组P-β-Catenin 0.56±0.031）0.54±0.031）0.33±0.022）0.46±0.031）2）0.47±0.021）2）

3.2 各组小鼠皮肤组织β-Catenin mRNA表达水平 见表2。

［4］ CHRISTMANN R B，PERCIVAL S B，GIUSEPPINA S，et al.Association of Interferon-and transforming growth factor β-regulated genes and macrophage activation with systemic sclerosisrelated progressive lung fibrosis ［J］.Arthritis&Rheumatology，2014，66（3）：714-725.

妈，你都退休了，怎么又喜欢大红大绿的衣服了？看见母亲身上花得夸张的衣服，苏楠突然想到了杨小水，尽管她们年龄相当，但杨小水决不会穿这样的衣服。

［3］ VERENA A，NISHA B，JOCHEN W，et al.WNT／β-catenin signaling induces IL-1β expression by alveolar epithelial cells in pulmonary fibrosis ［J］.American Journal of Respiratory Cell&Molecular Biology，2013，49（1）：96-104.

2.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行分析。计量资料属正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

［2］ WEI J，FANG F，LAM A P，et al.Wnt／β-catenin signaling is hyperactivated in systemic sclerosis and induces Smad-dependent fibrotic responses in mesenchymal cells ［J］.Arthritis&Rheumatology，2012，64（8）：2734-2745.

［1］ REBECCA M，FRANCESCO B.Immunotherapy of systemic sclerosis ［J］.Immunotherapy，2010，2（6）：863-878.

本研究结果显示：皮下注射生理盐水小鼠皮肤β-Catenin mRNA及蛋白表达量与未注射正常组无差异，可见皮下注射非药物对wnt／β-Catenin通路指标没有影响。qPCR及WB结果显示：模型组皮肤β-Catenin的mRNA和蛋白表达水平较正常组增强，可见BLM可以诱导硬皮病小鼠皮肤发生纤维化；经加味阳和汤干预后，硬皮病小鼠皮肤β-Catenin的mRNA及蛋白表达水平均明显降低，表明加味阳和汤对抗硬皮病皮肤纤维化确有疗效，其发挥治疗作用可能是通过抑制皮肤β-Catenin的活化，来减轻硬皮病模型小鼠的皮肤纤维化程度。

［5］ BEYER C，SCHRAMM A，AKHMETSHINA A，et al.β-catenin is a central mediator of pro-fibrotic Wnt signaling in systemic sclerosis ［J］.Annals of the Rheumatic Diseases，2012，71（5）：761-767.

由于学生的了解能力、兴趣与接受能力不同，学生的学习情况与进度必然存在着一定的差异，因此教师应该进行因材施教，充分融合教材内容制作难度不同的微课课件；以拓展学生的知识储备为目的，根据学生的日常生活环境创设完善的教学情境；以沟通交流为目的，建设完善的微课课堂，使其成为教师与学生之间进行交流和互动的平台。为了帮助学生更好的熟悉这种教学方法，同时也为了提高学生的学习兴趣和积极性，教师在进行课上教学时，要积极的应用网络与多媒体[2]。

［6］ 林丹丹，施红.施红教授应用阳和汤治疗系统性硬化病经验［J］.福建中医药，2016，47（2）：45-46.

［7］ 邓岱，刘文虎.Wnt／β-catenin信号通路在慢性肾脏病血管钙化中作用的研究进展［J］. 医学研究杂志，2016，45（1）：170-173.

［8］ CHRISTMANN R B，PERCIVAL S B，GIUSEPPINA S，et al.Association of Interferon-and transforming growth factor β-regulated genes and macrophage activation with systemic sclerosisrelated progressive lung fibrosis ［J］.Arthritis&Rheumatology，2014，66（3）：714-725.

第三个项目体现了医院各部门间的良好协同性，促进了节能项目的顺利开展。连续数月的数据显示锅炉运行时间延时之后，能源管理平台及时分析原因，发现是由于供应室任务量大、加班所致，对此拟定了数条解决方案。经过与相关部门的反复沟通，确定由总务处配合供应室进行清洗、蒸汽消毒设备增容改造，使得供应室工作流程得到优化，工作效率获得提高，锅炉供汽时间缩短2小时/天，蒸汽损失减少约159立方米/月。

［9］ GHOSH A K，SWATI B，ROBERT L，et al.p300 is elevated in systemic sclerosis and its expression is positively regulated by TGF-β：epigenetic feed-forward amplification of fibrosis ［J］.Journal of Investigative Dermatology，2013，133（5）：1302-1310.