1 引 言

脱水素，又称二族胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)，是一类与植物抗逆反应相关的重要蛋白质。这类蛋白质在植物胚胎发育晚期表达量十分丰富，在环境胁迫(如干旱、低温、盐碱等条件)下也会大量累积[1,2]。因此，脱水素被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的重要物质之一，是当前抗逆研究方面备受关注的一类蛋白质。脱水素的显著特点是拥有一个或多个富含赖氨酸的保守性K片段。截掉K片段，会使得脱水素ERD10、RcDhn5和TaDHN-5对脱氧脱氢酶(LDH)的低温保护活性降低[3,4]。K片段自身也可以对LDH起到低温保护作用[5]。 近期研究表明， 脱水素还具有抗菌活性，K片段在其中起关键作用，且K片段自身具有类似全长蛋白的抵抗革兰氏阳性菌活性[6]。在遭受各种胁迫的情况下，小麦脱水素的K片段通过阻止蛋白聚集对大肠杆菌起到保护作用，而且K片段也具有抗革兰氏阴性、阳性菌和真菌的活性[7,8]。河岸葡萄的K片段可以在受到冻融损害时阻止膜融合，并在不改变膜的流动性和表面可及性情况下降低膜转变温度，对膜起到重要的保护作用[9]。 上述研究结果表明， 在脱水素的低温保护及抗菌功能中，K片段发挥着至关重要的作用。尽管体内及体外实验证明了脱水素及K片段的重要性，但目前对其分子作用机制仍不完全清楚。功能是蛋白质结构的生化表现特征，结构是蛋白质行驶功能的基础。因此，研究脱水素及其重要功能区域的结构特征是全面认识其作用机制的有效途径。

脱水素具有高度灵活的结构，它包含大量亲水残基，被认为是天然无规蛋白。然而，当环境发生改变(如缺水或是与膜表面结合)时，脱水素可以形成一些有序结构[10]。K片段被预测可以形成两亲性的螺旋结构，因此推测其与脱水素的结构改变密切相关[10]。详细探究K片段的精细结构对于揭示K片段，甚至于整个脱水素的作用机理是非常必要的。核磁共振波谱(NMR)技术是原位研究溶液中蛋白质三维结构的主要分析方法，它不仅可在原子水平上提供蛋白质在生理条件下的空间结构[11～13]，还可通过观察蛋白质上个别基团的行为特点为分析其分子相互作用等研究提供重要信息。本研究以具有抗菌活性的大米脱水素K片段[6]作为研究对象，利用圆二色谱(CD)、NMR等多种谱学方法及分子动力学模拟计算等手段研究了K片段在模拟膜SDS胶束中的三维结构及其与模拟膜的相互作用方式， 为进一步了解K片段乃至脱水素抗菌及膜保护机理提供了精细的三维结构及取向信息。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

J-810圆二色谱仪(日本Jasco公司); AVANCE核磁共振波谱仪(600 MHz，Bruker 公司)。合成肽K片段(KKGFLDKIKEKLPGGHKK，纯度>95%,苏州强耀生物科技有限公司)。重水(D2O, 99.8%)、氘代十二烷基磺酸钠(SDS-d25, 98%)，均购于Cambridge Isotope Laboratories公司。实验用水为去离子水。

2.2 实验方法

2.2.1 远紫外圆二色谱(Far-UV CD) 样品制备：(1)水溶液中样品制备：将适量K片段直接溶于水中，肽的浓度为30 μmol/L。(2)SDS中样品制备：分别将适量K片段和SDS溶于水中，将肽溶液移入SDS溶液，旋转混匀，制得K片段浓度30 μmol/L、SDS浓度10 mmol/L的水溶液样品。

圆二色谱检测所用石英比色皿的光程为0.1 cm，波长扫描范围190～260 nm; 带宽1.0 nm; 实验检测温度为25℃。每个样品扫描3次，每张CD谱图取3次扫描图的平均值。CD谱图均已扣除背底，并以平均残基摩尔椭偏率(θMRE)表示：

θMRE =θobs/10lcn

(1)

其中， θobs(mdeg)是实验所测椭偏率， l(cm)是石英比色皿的路径长度， c(mol/L)是肽的浓度， n是多肽所含氨基酸个数。

蛋白质二级结构含量通过CDPro软件分析得到。

2.2.2 核磁共振波谱 样品制备：称取1.7 mg K片段溶于220 L水中，称取31.9 mg SDS-d25溶于275 L水中，将K片段溶液移入SDS-d25溶液，在混合溶液中加入55 L D2O，涡旋混匀，制得550 L的10% D2O-90% H2O的混合溶液，其中，K片段浓度为1.5 mmol/L、SDS-d25浓度为185 mmol/L。

海洋馆老板的话彻底激怒了民众。2011年11月，动物法律维权基金起诉国家海洋渔业服务部门NMFS，要求海洋馆终止“将洛丽塔排除在濒危动物保护法案之外”的行为，之后，他们又进一步起诉迈阿密海洋馆违反濒危动物保护法。

进一步利用NMR方法对K片段在SDS胶束溶液中的三维结构进行研究。根据Wüthrich提出的蛋白质NMR谱序列识别方法[18]，结合TOCSY给出的各氨基酸自旋体系的信息以及NOESY给出的欧沃豪斯效应关系对NMR谱图进行归属。NOESY谱中大部分相邻氨基酸残基间都存在NOE交叉峰，如HNi-HNi+1、Hαi-HNi+1和Hβi-HNi+1，部分不相邻的氨基酸间也存在NOE交叉峰，如Hαi-HNi+3、 Hαi-Hβi+3和Hαi-HNi+2等(部分NOESY谱图归属见图2)。其中，连续的HNi-HNi+1 NOE连接和Hαi-HNi+3、 Hαi-Hβi+3的NOE连接是反映α-螺旋结构的特征连接模式，表明K片段在SDS胶束溶液中主要以α-螺旋结构形式存在。

2.2.3 结构计算 三维空间结构通过CYANA软件(1.0.6版本4)计算得到。从200个随机的初始结构开始计算，通过几何空间的模拟退火计算寻找符合构象约束的三维结构。得到的结构按目标函数值从小到大进行排列，然后利用程序AMBER7对目标函数值排在前20的结构进一步进行能量优化，并用PROCHECK_NMR6程序对结构进行评估。利用MOLMOL7程序进行结构可视化分析和绘图。

3 结果与讨论

3.1 结构分析

根据NOESY谱输出的NOE连接图(图3A)可见，α-螺旋结构的特征连接模式主要存在于G3～L12区域，表明此区域形成了α-螺旋结构。进一步通过比较SDS胶束溶液中K片段各个残基的Hα化学位移值与它在水溶液中自由卷曲时各残基的Hα化学位移值，可获得化学位移标志(CSI)数据。如图3B所示，F4～E10区域存在连续的-1值，表明K片段在此区域形成了α-螺旋结构。以上核磁共振表征结果表明，在SDS胶束溶液中K片段的中间部分形成了α-螺旋结构， 与CD结果一致。

扩散排序(Diffusion-ordered spectroscopy, DOSY)核磁共振实验温度为298 K, 采用含有WATERGATE压水峰技术的BPPSTE(Bipolar pulse pair stimulated echo)脉冲序列。扩散时间为200 ms，梯度脉冲持续时间为4.5 ms，扫描次数为8。

尽管脱水素的膜保护功能及抗菌功能早已为人们所熟知，但对于其作用机理尚不清楚。本研究采用TOCSY和NOESY等核磁技术及分子动力学模拟从原子水平揭示了大米脱水素K片段在模拟膜SDS胶束溶液中的特定三维结构，并通过扩散实验、顺磁探针实验考察了K片段在SDS胶束中的取向。本研究结果表明，K片段可能通过形成两亲性α-螺旋结构起到与细胞膜结合并进入细胞膜的作用。其中，疏水残基F4、L5和I8形成螺旋结构的疏水面，便于K片段稳定存在于模拟膜中，这与近期研究发现疏水残基对脱水素功能至关重要[23]相一致。以上结果为K片段与膜的生物作用机制研究提供了重要的结构信息，也将为研究脱水素的膜保护功能及抗菌功能提供新的参考。

图1 在室温条件下，30 mol/L K片段在水溶液中和10 mmol/L SDS胶束溶液中的圆二色谱图 Fig.1 Circular dichroism (CD) spectra of 30 mol/L K-segment in water and 10 mmol/L SDS micelles at room temperature

图2 1.5 mmol/L K片段在185 mmol/L SDS胶束溶液中的Hα-HN区域局部NOESY谱图归属 Fig.2 Hα-HN region of NOESY spectrum for 1.5 mmol/L K-segment in 185 mmol/L sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles

许多与抗寒和抗旱相关的天然无规蛋白具有一个共同特点，即蛋白序列中都包含能促使蛋白与膜结合的结构基序。玉米脱水素ZmDHN1的删除研究表明，K片段可能负责将脱水素蛋白结合到不同膜上[10]，但具体作用残基及结合机理仍不清楚。本研究采用CD谱表征K片段在水溶液中和SDS胶束溶液中的二级结构。如图1所示，在水溶液中，K片段只在197 nm处有一个负的最低峰，表现为典型的自由卷曲结构; 在SDS胶束溶液中，K片段在206 和225 nm出现两个负的最低峰，在192 nm处出现一个正的最高峰，表明K片段在SDS胶束溶液中主要以α-螺旋结构存在[14]。利用CDPro软件中CDSSTR程序对肽的二级结构含量进行计算，得到α-螺旋含量为33.9%， β-折叠含量为21.1%，转角含量为15.8%， 自由卷曲含量为28.8%。上述结果说明SDS胶束会诱导K片段由无规结构向α-螺旋结构转变， 这与一些胁迫蛋白会在膜存在时形成α-螺旋结构[15～17]相类似。

图3 1.5 mmol/L K片段在185 mmol/L SDS胶束溶液中的NOE连接图(A)和CSI图(B) Fig.3 NOE connectivities (A) and CSI (B) for 1.5 mmol/L K-segment in 185 mmol/L SDS micelles

图4 SDS胶束中15个最佳收敛的K片段能量最低结构条带图(A)和骨架及部分侧链原子重叠图(B) Fig.4 Ribbon diagram (A) and superposition of backbone and partial sidechain atoms (B) of 15 best-converging energy-minimizing structures of K-segment in SDS micelles

为了进一步考察各氨基酸残基质子在空间上的分布情况和相对位置，以NOESY谱图中给出的化学位移和NOE强度为NMR约束，利用CYANA程序进行了分子动力学计算。所有NOE中共有177个有意义的上限距离约束，包括84个残基内约束(Intraresidual)、 60个残基间连接的约束(Sequential)和33个中等范围的约束(Medium)。根据NMR约束，利用CYANA软件，通过模拟退火方式对200个随机初始结构在扭转角空间进行分子动力学计算。得到的结构按目标函数值从小到大进行排列，然后用程序AMBER7对前20个具有最低目标函数值(平均值为0.0084 nm)的结构(距离约束不超过0.02 nm，角度约束不超过5°)进行能量最小化，求得平均能量为-232.17 kcal/mol。图4A显示了15个最低能量分子的条带结构重叠， 从F4至K9定义了一个比较好的α-螺旋结构。对于骨架原子，螺旋区结构与平均结构的均方根偏差为0.032 nm; 对于所有重原子，均方根偏差为0.13 nm。利用PROCHECK-NMR软件进行Ramachandran分析后发现，结构收敛较好的残基中86.7%的骨架二面角落入了最有利区域(Most favored region)，13.3%的骨架二面角落入了额外允许区域(Additionally allowed region)。MOLMOL计算结果表明，平均结构(Mean structrue，20个结构的平均)中残基G3、E10、K11和L12未被包含到α-螺旋结构中，但NOE连接预测这些残基是螺旋结构的延伸，CSI数据预测E10为螺旋结构的延伸。从图4B可见，K片段的螺旋结构表现出类似两亲性的残基分布，即疏水残基F4、L5和I8在一侧，极性残基D6、K7和E10在另一侧。这种两亲性α-螺旋分布特点将有利于K片段与膜发生相互作用。

全相关谱(Total correlation spectroscopy, TOCSY)和核的欧沃豪塞增强谱(Nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY)检测均采用压水峰技术，混合时间分别为80和150 ms，累积次数分别为64次和80次。采样数据矩阵2048512，延迟时间2 s，采样时间0.1548 s，谱宽6613.8 Hz。采用标准Bruker软件(TOPSPIN 2.1版本)进行谱图处理，处理后的谱图用SPARKY软件进行分析。选用TSP-d4作为内标。实验温度为298 K。

3.2 与模拟膜的结合

进一步采用顺磁性Mn2+作为探针离子，对K片段各残基相对SDS胶束的位置进行探测，从而确定K片段与模拟膜的作用模式(即K片段在SDS胶束中的取向)。由于弛豫速率增加，靠近Mn2+的原子核的核磁信号强度降低，距离Mn2+越近，核磁信号越弱，甚至消失。因为Mn2+不能进入胶束的疏水核区域，所以通过比较核磁信号强弱可间接判断对应残基在溶剂中的暴露程度。本研究考察了K片段在含有0.07 mmol/L MnCl2的SDS胶束溶液的2D1H-1H TOCSY谱交叉峰变化。Mn2+存在下，TOCSY谱中各残基Hα-HN交叉峰的相对强度如图5B所示，螺旋区域(F4～K9)受Mn2+影响相对较小，尤其是残基F4、L5和D6的信号强度只有小幅减弱，这说明螺旋区域插入到了SDS胶束当中，且以疏水面朝向胶束的疏水内核、亲水面朝向亲水头基层的方式存在。在C端区域(E10～K18)，Mn2+的加入使得这些残基的信号强度大幅降低，这表明结构较为无序的C端处于靠近溶剂的SDS胶束表层。N端区域(K1～G3)在加入Mn2+后，信号降低幅度略小于C端区域，说明N端区域插入SDS胶束比C端深。K片段所有区域中没有信号完全消失的残基，说明K片段没有彻底暴露在水中的残基。扩散及顺磁探针实验结果表明，K片段具备与膜结合的能力，支持了它在脱水素保护作用中负责结合膜的说法。

图5 (A)185 mmol/L SDS胶束中1.5 mmol/L K片段的DOSY谱图; (B)加入0.07 mmol/L Mn2+后，K片段各残基的相对核磁信号强度。 Fig.5 (A)DOSY spectrum of 1.5 mmol/L K-segment in 185 mmol/L SDS micelles; (B)Effect of 0.07 mmol/L Mn2+ on NMR signals of K-segment.

之前的文献已报道了LEA蛋白与膜之间的相互作用[19,20]。大豆LEA蛋白GmPM28和GmPM1被发现能够有效地维持磷脂体系的稳定性[19]。豌豆(Pisum sativum)线粒体LEA3蛋白(PsLEAm)能与线粒体膜发生相互作用，可能是通过形成螺旋构象方式保护脂质体[20]。本研究采用核磁的DOSY技术考察K片段与模拟膜的结合作用。DOSY技术可以测定溶液中分子的扩散系数(D)，从而间接关联分子的动力学半径, 目前已被广泛用于检测分子的聚集、配体-受体相互作用等[21,22]。如图5A所示，位于3.90、1.15和0.73 ppm处的SDS胶束(Mr=18803)谱峰和K片段(Mr=2051.53)谱峰(除SDS胶束和水峰外的所有信号峰)纵坐标相同，即扩散系数相同，表明K片段结合到了模拟膜SDS胶束上，形成稳定的结合体。

4 结 论

②加强新技术应用推广。一是利用3S技术将全市划分为1 085条小流域作为水土保持工作的基本单元，实现小流域按不同流域等级管理。二是针对农村污水排放特点，研究和开发了曝气生物滤池、膜生物反应器（MBR）等7种经济可行的农村污水处理技术。三是根据山区农民生产、生活方式，研究厨余垃圾堆肥技术，将分类收集的农村厨余垃圾沤制有机肥回用于农田。四是研制北京市土壤侵蚀模型，实现了全市土壤侵蚀的定量预测。五是引入欧盟水框架指令和近自然治理理念，开展小型水体生态修复示范。六是通过抗旱、耐寒、耐贫瘠及水土流失防治效果试验，筛选8种生态草种，研究3种库滨带建植模式。

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