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双功能石墨烯量子点的制备及在pH荧光检测和细胞成像中的应用

更新时间:2016-07-05

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pH值对细胞代谢、增殖、吞噬作用、离子转运、信号转导、凋亡等生命过程影响都有一定影响[1]。pH值的微小变化可能引发系列生命现象改变,因此,监测pH值变化是探索细胞功能和了解细胞内化的重要途径[2]。pH值异常变化可能造成细胞功能紊乱,导致细胞功能障碍、炎症、缺血性中风、类风湿性关节炎、囊性纤维化、癫痫发作以及心肺和神经退行性疾病[3]。血液pH值<7.35,属于酸中毒,是需要治疗的严重疾病。酸中毒多为某种疾病并发症[4]。代谢性酸中毒可由腹膜炎、休克、高热、肠瘘、急性肾衰竭等引起[5],而呼吸性酸中毒则是由脑膜炎、血栓、脊髓灰质炎、支气管哮喘以及广泛性肺疾病引起[6]。血液pH值>7.45,属于碱中毒,也是需要治疗的严重疾病[7]。哺乳动物细胞正常生理条件下的外液略呈碱性,在肿瘤形成情况下,pH值较正常值偏低[8]。因此,精确测定pH值具有重要的理论和实际应用价值。

(2) 试剂。乳酸链球菌素、海藻酸钠、柠檬酸、魔芋葡甘聚糖、甘氨酸,以上试剂均为食品级、生物试剂;生姜,购自学校附近集贸市场。

测定pH值常用pH响应电极、传感器和试纸。pH电极和传感器在使用中存在一些限制,包括需要参比电极和频繁的校准、对电活性成分敏感以及信号不稳定[9]。pH试剂使用方便,但测定精度不高。上述方法都不适合细胞内pH值的测定。近年来, 对pH值响应的有机[10]和无机发光材料[11]引起广泛关注。主要的发光材料有半导体量子点[12]、金属纳米簇[13]、非金属纳米簇[14]、碳量子点[15] 和石墨烯量子点[16]。不同于传统方法,光学探针法是一种非接触式方法,更适合细胞水平上的pH值监测。此外,荧光探针法还具有操作简单、检测快速和灵敏高等特点。然而,现有光学材料在生物相容性性、发光效率和通过细胞膜磷脂双分子层的能力方面仍不理想。

石墨烯量子点是一种准零维的纳米材料,尺寸仅有几纳米,具有显著的量子局限效应和独特的光电性能[17,18]。相比于半导体量子点,石墨烯量子点具有更好的生物相容性、发光强度、光稳定性和环境友好性[19]。目前,石墨烯量子点已应用于太阳能电池[20]、光学器件[21]、生物标记[22]、细胞成像[23]、电化学传感器[24]、超级电容[25]和锂离子电池[26]等方面。为进一步改善pH值光学响应,本研究设计合成五乙烯六胺(PEHA)和十二胺(DA)双功能化石墨烯量子点(PEHA-GQD-DA)。PEHA-GQD-DA具有优异的光学性能,并被用于水样pH值荧光检测和Hela细胞成像。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Cary Esclipse荧光光度计(美国瓦里安公司); JEM-2100(HR)透射电子显微镜(日本JEOL 公司); Nicolet iS50 FT-IR傅立叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技公司); S-4800场发射扫描电子显微镜(日本日立株式会社); TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

图5是PEHA-GQD-DPA的荧光激发光谱和荧光发射光谱。PEHA-GQD-DPA的激发光谱在356 nm处有一个强的吸收峰,最大吸收波长明显大于小分子化合物,说明形成了具有更大电子共轭体系的石墨烯片[28]。PEHA-GQD-DPA的荧光发射峰位于375~600 nm之间,最大发射波长为450 nm。PEHA-GQD-DPA的荧光量子产率达到72.7%(以罗丹明B为标准物采用参比法测定),明显高于以单一柠檬酸为碳源制备的石墨烯量子点(17.2%)[29],说明PEHA和DA的引入显著提高了石墨烯量子点的荧光发射。用氙灯(300 W)对装有PEHA-GQD-DA溶液的石英比色皿持续照射,每隔10 min测量溶液在450 nm处的荧光强度。PEHA-GQD-DA溶液的荧光强度在70 min照射时间内基本不变,光稳定性良好。

2.2 PEHA-GQD-DA制备

结合上述法律的规定,继续盘问制度是指公安机关的人民警察对于当场不能够解除或确认其违法犯罪嫌疑的人员,按照法律规定将其带至公安机关进一步盘问、检查,以最终确定相对人是否违法或犯罪的法律制度。

2.3 荧光检测

将200 μL PEHA-GQD-DA工作液(0.05 mg/L)转移至2 mL离心管中,依次加入200 μL水(或环境水样)和600 μL BR缓冲溶液(pH 7.0),摇匀,以360 nm为激发波长,测量荧光光谱或荧光强度。

2.4 细胞成像

PEHA-GQD-DA制备包括二步热解反应,如图1所示。首先,以柠檬酸和PEHA混合物为碳源热解形成PEHA-GQD。然后,PEHA-GQD再与DA缩合得到PEHA-GQD-DA。柠檬酸主要是通过分子间脱水及随后的碳化过程形成由sp2碳原子组成的石墨烯片[27]。PEHA和DA都是功能性试剂,通过分子中的氨基与柠檬酸分子中的羧基缩合将功能基团引入到石墨烯片的边缘,实现石墨烯量子点的功能化。PEHA分子中有6个氮原子,它的强供电子作用显著增加了石墨烯片的电荷密度,从而提高了石墨烯量子点的荧光发射性能。此外,PEHA分子中的基团可通过在不同酸度下的质子化和离解改变石墨烯片的电学特征,使石墨烯量子点能对介质pH值改变产生灵敏的光学响应。尽管DA也能产生供电子效应,对石墨烯量子点荧光增强起到一定作用,但它的主要功能是在石墨烯片边缘引入疏水性烷基链。烷基链的引入使PEHA-GQD-DA具有典型的双亲结构,以有利于量子点通过细胞膜磷脂双分子层而进入到细胞内部。另一方面,柠檬酸、PEHA和DA都是化学活性化合物,在加热条件下,同种分子或不同分子之间可缩合形成多种碳纳米材料,这可能直接影响到产物纯度和光学性能。然而,两步热解法可较好地解决这一问题。在室温下,在第一步反应中,柠檬酸与PEHA通过酸碱反应形成盐; 然后,在高温下,热解形成PEHA-GQD。由于150℃的反应温度超过了柠檬酸分子缩合和碳化以及柠檬酸中羧基与PEHA中胺基缩合反应的温度,但并未达到PEHA的碳化温度,因此反应产物中不存在PEHA碳化产生的碳纳米材料。第一步反应完成后,柠檬酸被转化为石墨烯片,PEHA被共价连接到石墨烯片边缘。因此,在第二步反应中,只有石墨烯片边缘上的羧基能与DA分子中的胺基反应,以实现对PEHA-GQD的功能化。

3 结果与讨论

3.1 PEHA-GQD-DA制备

将Hela细胞转移到含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2条件下培养。成像实验前,将细胞转移至共聚焦专用培养皿,培养6 h,用5 mL PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤3次。加入20 μg/mL PEHA-GQD-DA溶液,于37℃、5%CO2的条件下培养4 h,用5 mL PBS缓冲溶液(pH 7.4)洗涤3次, 去除残余量子点,选择490 nm激发光,在共聚焦荧光显微镜上进行荧光成像。

图1 五乙烯六胺和十二胺功能化石墨烯量子点(PEHA-GQD-DA)的合成方案 Fig.1 Scheme for synthesis of pentaethylene hexamine and dodecylamine functionalized graphene quantum dots (PEHA-GQD-DA). CA, citric acid

图6是不同pH值下PEHA-GQD-DA的荧光发射光谱。当介质pH值<6.5时,石墨烯量子点的荧光强度(Fp)随pH值增加而增大,其线性方程为Fp=152.72pH-15.85,相关系数R2=0.998。同时,不同pH值下荧光光谱也存在明显差异。最大发射波长(W)与pH值之间存在良好的线性关系,线性方程为W(nm)=-6.2539pH + 478.15,R2=0.996。因此,荧光强度和最大发射波长均可用于酸性范围内pH值的定量测定。然而,碱性范围内pH值变化不会引起石墨烯量子点的发射光谱变化。随着pH值增加,荧光强度迅速下降,Fp与pH值保持良好的线性关系,线性回归方程为Fp=-113.83pH+1536.6,R2=0.995。因此,荧光强度的变化可用于碱性范围内pH值的定量测定。PEHA-GQD-DA含有丰富的含氧基团,因此荧光信号的变化应主要归因于含氧基团的质子化和离解。

图2 (A)不同PEHA/CA下所制备PEHA-GQD的荧光光谱(插图:峰荧光强度随PEHA/CA的变化),(B)不同PEHA/CA下所制备PEHA-GQD的紫外-可见吸收光谱(插图:峰强度随PEHA/CA的变化) Fig.2 (A) Fluorescence spectra of PEHA-GQD samples prepared by using different ratios of PEHA/CA (Inset: change of peak fluorescence intensity with PEHA/CA). (B) UV-visible absorption spectra of PEHA-GQD prepared by using different ratios of PEHA/CA (Inset: change of peak intensity with the PEHA/CA)

通过改变DA的加入体积,考察了DA用量对PEHA-GQD-DA光学性质的影响。从图3A可见,PEHA-GQD-DA的荧光发射强于PEHA-GQD,说明DA的引入进一步提高了荧光强度。这是因为DA分子中存在强供电子氨基,进一步改善了量子点的荧光发射强度。然而,当DA加入量>15 μL时,体系中将析出沉淀,降低了水溶液中PEHA-GQD-DA的浓度, 从而导致荧光强度降低。这可能是因为石墨烯片边缘上引入较多的烷基链,导致水溶性明显降低。因此,本研究选用15 μL DA制备PEHA-GQD-DA。

图3 (A) PEHA-GQD (a) 和PEHA-GQD-DA (b) 的荧光光谱; (B) 荧光强度与加入DA体积的关系曲线 Fig.3 (A) Fluorescence spectra of PEHA-GQD (a) and PEHA-GQD-DA (b); (B) Relationship between fluorescence intensity and amount of dodecylamine

图4 PEHA-GQD-DA的透射电镜图(A)、原子力显微镜图(B, C)和红外光谱图(D) Fig.4 Transmission electron microscopic (TEM) image (A), atomic force microscopic (AFM) images (B, C) and Fourier transform infrared (FTIR) spectrum (D) of PEHA-GQD-DA

3.2 结构表征

采用透射电镜、原子力显微镜和红外光谱对PEHA-GQD-DA的结构进行表征,结果见图4。PEHA-CD-DA由准零维的石墨烯片组成,石墨烯片形貌单一,未发生明显的团聚现象,尺寸在1~3 nm之间,平均片径为2.2 nm,小于单独柠檬酸制备的石墨烯量子点的平均片径(5.6 nm)。这是因为PEHA可与柠檬酸能迅速反应,形成稳定的共价键,消耗了柠檬酸分子中的部分羧基,使石墨烯片的生长受到限制,导致形成较小的石墨烯片。通常,尺寸越小,量子限制效应更明显,可能产生更强的荧光发射。3500~3300 cm-1之间的吸收带是键的对称伸缩振动峰,3500 cm-1处的吸收峰为键的对称振动峰,3000~2800 cm-1之间的吸收带是键的伸缩振动峰,1741、1218、1066和1723 cm-1处的吸收峰是基团的伸缩振动,3162、1643和1535 cm-1处的吸收峰是基团的红外吸收。以上红外光谱的分析结果证明,PEHA-GQD-DA中含有等功能基团。

胶原蛋白肽作为一种新型的功能食品配料在全球范围内广泛应用。胶原蛋白肽在市场上通常称为胶原蛋白,是以动物的皮、骨、鳞等部位经酶解后产生的产物。因动物疾病和宗教信仰等原因,海洋鱼胶原蛋白肽深受国内消费者喜爱。近年来,因“低聚肽”概念的兴起,有报道称分子量低的胶原低聚肽吸收性好于高分子量产品[1]。本文研究了鳕鱼皮胶原低聚肽对面部肤质改善的临床情况。

3.3 光学性质

图5 PEHA-GQD-DA的激发光谱(a)和荧光发射光谱(b)。插图分别为在白光(c)和紫外光(d)下的光学照片 Fig.5 Excitation spectrum (a) and fluorescence emission spectrum (b) of PEHA-GQD-DA. Inset: Optical photographs under white light (c) and ultraviolet light radiation (d)

柠檬酸(CA)、五乙烯六胺(PEHA)、十二胺(DA)、NaOH、H3PO4、乙酸和H3BO3(国药集团化学试剂公司)。BR缓冲溶液:将0.04 mol/L H3PO4、乙酸和H3BO3混合,加入不同体积的0.02 mol/L NaOH,得到不同pH值的BR缓冲溶液。实验用水均为二次蒸馏水。

3.4 对pH值的荧光响应

为考察PEHA用量的影响,通过改变PEHA和柠檬酸的比例(PEHA/CA)制备了系列PEHA-GQD。图2A是PEHA-GQD的荧光光谱。当PEHA/CA<0.4时,随PEHA的比例增大,荧光强度迅速增强。这种荧光增强效应主要归因于PEHA的供电子效应。一方面,PEHA含有氨基和亚氨基两种强供电子基团,增加了石墨烯片电子云密度,从而导致荧光发射强度增加。采用更高比例的PEHA将引入更多的供电子基团,因此导致更强的荧光发射。另一方面,PEHA和柠檬酸可通过酸碱反应形成盐。PEHA的供电子效应将提高柠檬酸的化学活性,柠檬酸分子更容易脱水缩合形成更多的石墨烯片,从而导致荧光强度的增加。图2B是不同PEHA-GQD的紫外-可见吸收光谱, 在350 nm处有一个较强的吸收峰,它的最大吸收波长明显大于小分子化合物的紫外吸收,证明形成了具有较大电子共轭体系的石墨烯片。随着PEHA比例的增加, 350 nm处的吸光度迅速增加,说明形成了更多的石墨烯片。当PEHA的比例>0.4时,荧光发射强度和吸光度都明显下降。这可能是因为柠檬酸与PEHA之间的化学反应消耗了柠檬酸分子中的羧基,使柠檬酸热解形成石墨烯片的能力下降,甚至不能形成石墨烯,从而导致荧光强度降低。为了得到高的荧光发射,选用PEHA/CA=0.4的条件制备PEHA-GQD。

图6 不同pH值下的荧光光谱(A,B)及峰荧光强度(C)和最大发射波长(D)与pH值关系曲线。 Fig.6 Fluorescence spectra (A, B) and relationship curves of peak fluorescence intensity (C) and maximum emission wavelength (D) with pH value

采用CCK-8方法对PEHA-GQD-DA的细胞毒性进行测试。结果表明,PEHA-CD-DPA浓度在0~1000 μg/mL之间,细胞活力保持基本不变,说明PEHA-GQD-DA具有非常低的细胞毒性。将Hela细胞与PEHA-GQD-DA孵育不同时间,然后在共聚焦显微镜上进行荧光成像。从图8可见,PEHA-GQD-DA处理2 h后,细胞产生较强绿色荧光,且荧光强度不再随孵育时间的延长而增强,说明大部分PEHA-GQD-DA已进入到细胞内部。然而,同样条件下用GQD处理的细胞的荧光却很弱。当延长孵育时间到8 h,GQD处理的细胞荧光强度才达到最大,但仍十分微弱。PEHA-GQD-DA细胞成像能力较好,主要归因于它的特殊结构:一方面,PEHA的引入提高了荧光强度,使成像更为清晰; 另一方面,DA的功能化提供了特殊的双亲结构,使量子点更易通过细胞膜磷脂双分子层而进入到细胞内部,避免了水溶性量子点滞留在细胞外的问题。

图7 不同无机离子存在下PEHA-GQD-DA的荧光保持率 Fig.7 Fluorescence retention ratio of PEHA-GQD-DA in the presence of different inorganic ions

3.5 实际水样pH值的测定

为检验PEHA-GQD-DA用于水样pH值测定的实用性,收集了3个环境水样品(自来水、雨水和湖水)和2个电镀废水样品,按2.3节所述方法进行荧光测定,结果列于表1。本法测定结果与酸度计的测定结果具有较好的一致性,表明本方法具有较高的实用性。

在25 mL烧杯中,加入4.2 g一水柠檬酸,用5 mL水溶解,边搅拌边滴加1.86 g PEHA。将烧杯转移至烘箱中,于100℃下加热除去游离水,升温至150℃并保温0.5 h,然后降温至100℃。在剧烈搅拌下加入15 μL DA,升温至160℃,继续反应1.5 h,冷却至室温。将得到的PEHA-GQD-DA配制成0.05 mg/L的溶液,用1 mol/L NaOH调节至pH 7,用0.22 μm滤膜过滤,在截留分子量3 kDa的透析袋中透析24 h,得量子点储备液,4℃保存,备用。

3.6 肿瘤细胞成像

PEHA-GQD-DA的主要功能基团是氨基、亚氨基、羟基和羧基,它们可能与过渡金属离子配合,干扰pH值的光学响应。为评估pH值测定的选择性,分别测定了加入不同干扰组分后石墨烯量子点体系的荧光光谱变化。结果表明,1.0 mg/mL的Li+、Ag+、Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Al3+、Cl-的引入,仅引起峰荧光强度的微小变化(图7),荧光强度仍保持在最初强度的95%以上。除无机离子外,环境和细胞内还可能存在一些有机小分子化合物,它们可能与石墨烯量子点之间相互作用,导致体系荧光发射的改变。研究表明,1.0 mmol/L的葡萄糖、多巴胺、草酸、尿素、谷胱甘肽、赖氨酸的存在并不影响量子点对介质pH值的荧光响应。因此,本方法具有较好的选择性。

表1 环境水样pH值测定结果 (n=5)

Table 1 Detection results of pH value in environmental water samples (n=5)

水样Watersamples本方法测定Thismethod酸度计测定pHmeter自来水Tapwater7.2±0.047.1±0.06雨水Rain6.6±0.056.7±0.02湖水Lakewater6.9±0.086.9±0.1电镀废水1#Electroplatingwastewater1#3.5±0.043.6±0.01电镀废水2#Electroplatingwastewater2#4.3±0.044.5±0.11

图8 Hela细胞在PEHA-GQD-DA(A,C)和GQD(B,D)中孵育后的明场(A,B)和荧光显微照片(C,D) Fig.8 Bright field images (A,B) and confocal fluorescence microscopy images (C,D) of Hela cells after incubated with PEHA-GQD-DA (A,C) and GQD (B,D)

4

通过引入供电子基团和烷基链, 成功合成了一种双功能石墨烯量子点,可作为各种光学检测和生物成像的荧光探针。通过构建具有不同离解和质子化的功能基团体系,可实现对介质pH值灵敏光学响应,可用于不同需求下pH值的精准测定及实时监测。研究结果表明,功能基团的引入可改变石墨烯量子点的性能,明显改善其光学性能,为设计基于石墨烯量子点的新型荧光材料提供了参考。

我国的经济正在进入深化改革的阶段,社会资源的供需矛盾正在加剧。最明显的问题就是社会利益分配不均。由于法律制度存在滞后性,而我国的发展速度非常快,造成了法律法规的建设无法跟上社会的发展速度。普遍存在的问题是对权利的监督不完善,导致社会不公平的问题较多,影响青少年价值观的形成。需要加快社会保障制度的完善,提高法律法规的规范化,做到有法可依和有法必依。

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《分析化学》 2018年第05期
《分析化学》2018年第05期文献

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