1 引 言

从药用植物中寻找活性物质、发现新的药源分子， 一直是新药研究的重要内容。药用植物物种多样，所含化学成分种类繁多，为新药研发提供了丰富资源。然而，传统的药用植物药效成分研究方法难以全面反映化学成分及其体内分布，以及生态环境对其体内物质的影响。植物代谢组学研究是从整体出发，系统地分析植物中的所有小分子物质及其随时间、环境的变化，有利于药用植物物质基础及其功能的阐明、物种的判断及预测等[1]。目前，液相色谱-串联质谱联用技术(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)作为代谢组学研究中的常用分析手段，因其具有高灵敏、高通量、特异性强的特点，可高效、快速、准确地研究植物内源性代谢物的动态变化信息，为阐明药用植物复杂代谢体系提供分子依据[2～8]。

新疆一枝蒿植物(Artemisia rupestris L.)为菊科蒿属、多年生草本植物，主要分布在我国新疆天山、阿勒泰等地区，全草入药。作为新疆维吾尔医学的传统用药，新疆一枝蒿具有抗炎、保肝、抗过敏、抗病毒、抑菌、抗肿瘤等多方面的药效作用[9～11]，有较高的药用价值。新疆一枝蒿中化学成分种类繁多，含有黄酮类[12]、生物碱类、倍半萜类[13，14]、多糖类等。文献报道该植物中黄酮类和倍半萜类化合物是含量较为丰富的活性成分，如倍半萜类次生代谢物一枝蒿酮酸是代表性的特征有效成分[15]。新疆一枝蒿药材资源多依靠野生采挖，由于该植物具有独特的生态特性，自然繁殖极为困难，并且近年来被大量开发利用，加上矿山开采、过度放牧等原因，野生药材资源已经匮乏，因而新疆一枝蒿的引种、驯化、人工栽培研究得到了重视。在临床上采用人工栽培品种代替野生品种使用，但两者药效物质基础是否一致尚存争议。目前，新疆一枝蒿的药效物质基础研究主要包括化学成分的分离鉴定[16]、有效成分的含量测定[17]、质量标准分析[18]等。但这些研究多采用传统分析方法，分离提取过程耗时，分析通量有限，且仅针对少数几种化合物，无法高效、系统、全面地表征新疆一枝蒿的药效物质基础。

①统计两组患者的血糖控制效果，包括护理前和护理后的空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 hPG）和糖化血红蛋白（HbAlc）；②统计两组患者的并发症发生情况，以甲亢危象、酮症酸中毒、低血糖等并发症发生率进行评估。

泡脚可以起到温经散寒、疏通气血、调整脏腑功能的作用。坚持热水泡脚足疗的应用范围很广，风湿病、脾胃病、失眠、头痛、感冒等全身性疾病，截瘫、脑外伤、中风、腰椎间盘突出症、肾病等大病、重病后的康复治疗等等都包括在内。

本研究采用高通量的LC-MS/MS技术分析新疆一枝蒿，通过重点考察属于黄酮类和倍半萜类的一枝蒿酮酸、异槲皮苷、芦丁、紫花牡荆素、洋艾素、金合欢素、蒙花苷、刺槐素8个内源性代谢物，结合代谢物覆盖度对提取溶剂及比例、复溶溶剂比例、超声时间等条件对前处理方法进行了优化，建立了适用于新疆一枝蒿植物代谢组学研究的LC-MS/MS分析方法，以期获得新疆一枝蒿更加全面的代谢组信息，同时结合多变量统计分析，寻找新疆一枝蒿不同组织器官之间的代谢组差异，初步揭示了该药用植物的代谢组学特征和规律，并为后续人工栽培品种和野生品种的药效物质基础研究及其质量控制提供了新的分析手段。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Ultramate 3000超高效液相色谱、 Q-OT-qIT杂合型质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos)、移液器(美国Thermo公司); 冷冻干燥机、真空离心浓缩仪(德国Christ公司); 离心机、混匀仪(德国Eppendorf公司); 高速分散机(德国IKA公司); 0.22 μm滤膜(美国Agilent公司)。

乙腈、甲醇(德国Merck公司); 甲酸(美国ROE公司); 乙酸乙酯(美国Honeywell公司); 氯仿(美国Mreda公司); 所有试剂均为色谱纯; 实验用水为某品牌纯净水。

转染24 h后，细胞在RIPA缓冲液中裂解。蛋白质通过10% SDS-PAGE加载和分离，并转移到PVDF膜(MiLople，Bead Foad，MA，美国)。在4℃下，用第一抗体孵育膜，然后用HRP标记的二次抗体在37℃孵育2 h，ECL作为底物进行显色，用β-actin作为内参。

对照品一枝蒿酮酸、异槲皮苷、芦丁、紫花牡荆素、洋艾素、金合欢素(辰光生物公司); 刺槐素(成都克洛玛生物科技公司); 蒙花苷(中国食品药品检定研究院)。

2.2 实验方法

2.2.1 样品采集与制备 盛花期新疆一枝蒿采自新疆维吾尔自治区富蕴县(人工栽培品种，于2014年8月育苗，2015年6月底～7月初移栽至大田)，采集后立即置于装有干冰的保温盒中暂存，并尽快转移至-80℃保存。取新疆一枝蒿根、茎、枝、叶、花，使用研钵在液氮中研磨成粉，粉末冷冻干燥48 h。称取(50±1) mg 冻干粉末于匀浆管中，冰浴条件下使用1 mL甲醇-水(80∶20，V/V)溶液在高速分散器中提取3 min(25000 r/min，1 min; 3000 r/min，1 min; 25000 r/min，1 min)，超声10 min后离心10 min(13500 r/min)，置于真空离心浓缩仪中浓缩3 h。将浓缩物复溶于1 mL乙腈-水(50∶50，V/V)，超声混匀后离心10 min，使用0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，备检。

2.2.2 色谱条件

Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司); 水(含0.1%甲酸，A)和乙腈(含0.1%甲酸，B)为流动相; 流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL，柱温为40℃; 梯度洗脱：每次进样前用初始流动相平衡8 min; 0～20 min，5%～50% B; 20～27 min，50%～98% B; 27～30 min，98% B; 30～30.1 min，98%～5% B。

2.2.3 质谱条件 离子源为电喷雾(Electrospray ionization, ESI)源; 采用正、负离子检测模式; 扫描模式为全扫描; 扫描范围 m/z 150～1000; 分辨率 60000; 喷雾电压3.5 kV(正离子模式)， -3 kV(负离子模式); 鞘气 0.24 MPa; 辅助气 0.10 MPa; 离子源温度 350℃(正离子模式)，380℃(负离子模式)。

2.2.4 数据处理 获得正、负离子检测模式下的UHPLC-(±) ESI-MS谱后，采用数据格式转换软件MSConvert将原始数据(.raw格式)转换成为mzXML格式文件，并导入开源数据处理软件XCMS进行峰识别、峰对齐、峰填充及峰过滤，最终获得包括质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)及其峰面积的二维数据阵。将上述获得的二维数据阵导入SIMCA-P(version 12.0, Umetrics AB, Umeå, Sweden)进行多变量统计分析，利用主成分分析(Principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least square-discriminant analysis, OPLS-DA)对样品进行模式识别，选择对分组贡献较大的变量(VIP>1)，进一步采用带有Jack-knifed置信区间(未跨越零值的变量被认为是可信的变量，此条件用于变量的筛选)的载荷图及原始轮廓图进行筛选,去除变异较大、组间交差严重的变量，再对两组独立样本进行t检验，选择p <0.05的变量，运用Pearson相关性分析进一步筛除加合离子、同位素离子及碎片离子，最终获得可靠的差异变量。根据差异代谢物的高分辨m/z及MS/MS谱数据，结合代谢物数据库Metlin(http://metlin.scripps.edu)检索,确定差异代谢物的类别。

2.3 方法学验证

2.3.1 仪器精密度 取新疆一枝蒿花的冻干粉末，按2.2.1节方法制备提取液，对同一样品连续进样6次，计算一枝蒿酮酸、异槲皮苷、芦丁、紫花牡荆素、洋艾素、金合欢素、蒙花苷、刺槐素8个内源性代谢物峰面积的RSD，对仪器精密度进行考察。

2.3.2 方法精密度 同一天内平行制备提取液6份，计算不同时间洗脱的8个内源性代谢物峰面积的RSD，评估方法的批内精密度; 3天内连续制备18份提取液，计算上述8个内源性代谢物峰面积的RSD，评估方法的批间精密度。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理及参数优化

仪器精密度考察结果表明，正、负离子模式下各代谢物提取离子流峰面积的RSD均小于6.3%，表明仪器精密度良好。

3.1.1 提取溶剂的选择及其比例的优化结果 为覆盖更广极性范围的代谢物，在文献调查的基础上[21]，本研究首先比较了甲醇-水(95∶5; 80∶20; 50∶50，V/V)、乙腈-水(95∶5; 80∶20; 50∶50，V/V)、乙酸乙酯-水(95∶5; 80∶20; 50∶50，V/V)、甲醇-氯仿-水(90∶5∶5; 80∶10∶10; 60∶20∶20，V/V)作为提取溶剂时的提取效果。获得的原始谱图数据，经格式转化及XCMS软件进行预处理后，各提取溶剂体系获得的色谱峰数目比较结果如图1所示。为清晰显示比较结果，计算各提取溶剂获得的色谱峰数占所有提取溶剂获得的色谱峰数目总和的百分比。结果表明，甲醇-水(80∶20，V/V)提取得到6985个色谱峰，相同溶剂类型下此比例获得峰数目最多; 同理，乙腈-水(80∶20，V/V)提取得到6561个色谱峰，乙酸乙酯-水(95∶5，V/V)提取得到5284个色谱峰，甲醇-氯仿-水(60∶20∶20，V/V)提取得到7541个色谱峰，分别为各类型提取溶剂的最佳比例。通过不同提取溶剂体系进行比较表明，甲醇-氯仿-水(60∶20∶20，V/V)提取的离子峰数目最多，其次为甲醇-水(80∶20，V/V)。

图1 不同提取剂获得的色谱峰数目比较，MeOH：甲醇; ACN：乙腈; EAC：乙酸乙酯; CHCl3∶氯仿 Fig.1 Comparison of peak numbers using different extract solvents. MeOH∶ Methanol; ACN∶ Acetonitrile; EAC∶ Ethyl acetate; CHCl3∶ Chloroform

采用建立的LC-MS/MS代谢组学方法分析了新疆一枝蒿根、茎、枝、叶、花不同组织器官的代谢组。由各组织器官的二维数据阵构建PCA模型得分图，如图4所示。结果表明，正、负离子检测模式下，各组之间具有明显的分组趋势，表明各组织器官的代谢组有显著差异，尤其是花与其它组织器官之间的差异最为明显。

图2 基于不同提取溶剂获得的(A)UHPLC-(-) ESI-MS数据和(B)UHPLC-(+) ESI-MS数据构建的PCA模型得分图，MeOH：甲醇; ACN：乙腈; EAC：乙酸乙酯; CHCl3：氯仿。 Fig.2 PCA score plots based on (A) UHPLC-(-) ESI-MS data and (B) UHPLC-(+) ESI-MS data from different kinds of extract solvents. MeOH: Methanol; ACN: Acetonitrile; EAC: Ethylacetate; CHCl3: Chloroform.

3.1.2 超声时间的选择结果 在代谢物提取过程中采用超声进行辅助提取，考察了超声时间(0、10、20和30 min)对提取效率的影响，比较了各超声条件下获得的色谱峰数目。结果表明，超声0、10、20和30 min时，可分别提取6347、6349、6146和6479个色谱峰，表明超声30 min提取的色谱峰数目最多，但差别不大。为避免提取过程产生热量使代谢物信息发生改变，实验不仅需要在冰浴条件下进行提取，超声时间也不应过长。综合以上所述因素，最终选择适宜的超声时间为10 min。

3.1.3 复溶溶剂比例的优化结果 在复溶溶剂的选择过程中，为尽量避免造成峰展宽、峰分叉现象的溶剂效应，选择了与流动相匹配的乙腈-水为复溶溶剂，并在此基础上优化有机相比例，考察了乙腈-水的体积比分别为5∶95、20∶80、50∶50、80∶20时的提取效果。结果表明，在正离子检测模式下，乙腈-水的体积比为5∶95、20∶80、50∶50、80∶20时分别检测到了8611、9559、11006、9691个色谱峰，且在负离子模式下分别检测到了7193、7128、8233、6297个色谱峰。乙腈-水(50∶50，V/V)为复溶溶剂时，在正、负离子模式下检测的色谱峰数目均为最多。因此，最终选择复溶溶剂为乙腈-水(50∶50，V/V)。

3.1.4 色谱与质谱条件的优化结果 色谱条件的优化：选用代谢组学研究中常用HSS T3色谱柱[22](100 mm×2.1 mm， 1.8 μm，Waters公司)，考察乙腈-水、甲醇-水等流动相体系及其比例、进样体积、流速、梯度洗脱程序、柱温等对色谱分离的影响。结果表明，甲醇-水为流动相时，弱极性部分的分离效果不及乙腈-水，同时甲酸的加入有利于抑制峰拖尾现象，因此选择乙腈(含0.1%甲酸)-水(含0.1%甲酸)为流动相; 优化后的总离子流色谱图(Total ion chromatograms, TICs)如图3所示，在进样量为5 μL，流速为0.3 mL/min，梯度洗脱时间为30 min，柱温为40℃的条件下，各色谱峰的分离效果良好。

图3 正离子检测模式LC-MS分析获得的新疆一枝蒿的总离子流色谱图 Fig.3 Total ion chromatograms (TICs) by liquid chromatography-mass spectrometric (LC-MS) analysis on Artemisia rupestris L. in positive ion mode

方法精密度考察结果表明，8种代谢物提取离子流峰面积的批内RSD和批间RSD分别小于11.8%和14.7%，表明方法精密度良好; 连续测定3天，各代谢物保留时间的RSD<0.5%，说明色谱系统稳定性良好。综上所述，在仪器精密度良好的前提条件下，本方法精密度、稳定性良好，可用于新疆一枝蒿植物样本的分析。

3.2 方法学验证

采用上述建立的前处理方法和UHPLC-(±)ESI-MS分析方法，针对人工栽培品种的新疆一枝蒿样品中-已知内源性代谢物的分析检测情况进行了系统考察。选择文献[12～14]报道的新疆一枝蒿中具有活性的8种倍半萜类和黄酮类成分，其检测情况及考察结果如表1所示。

植物代谢组学的样品前处理步骤对最终实验结果至关重要[19]，提取代谢组信息时应尽可能兼顾代谢物不同的理化性质，保持代谢组的原始性和完整性。目前，溶剂提取是最为常用的提取方法[20]，提取溶剂种类及比例、是否使用超声及超声时间、复溶溶剂及比例均会影响实验结果，因此本研究对上述参数进行了细致的考察与评估。

表1 正、负离子检测模式下仪器精密度和方法精密度的考察结果

Table 1 Results of instrument and method precision in positive and negative ion mode

化合物Compound仪器精密度RSD(%，n=6)InstrumentprecisionESI(+)AreaRtESI(-)AreaRt方法精密度RSD(%)Methodprecision批内(Intra⁃batch，n=6)ESI(+)AreaRtESI(-)AreaRt批间(Inter⁃batch，3days，n=18)ESI(+)AreaRtESI(-)AreaRt一枝蒿酮酸Rupestonicacid2．80．02．30．04．30．06．70．03．80．14．10．2芦丁Rutin2．30．91．60．06．00．19．20．14．40．15．90．5紫花牡荆素Casticin2．20．02．40．04．90．05．90．13．70．15．00．2异槲皮苷Hirsutrin5．70．14．70．06．70．111．80．110．10．114．70．4金合欢素Acacetin4．90．14．40．08．00．08．80．04．90．15．30．2刺槐素Robinin--6．30．1--10．00．1--11．90．5蒙花苷Linarin4．80．03．90．07．20．08．00．04．50．15．40．2洋艾素Artemitin4．80．1--7．70．0--5．30．0--∗ESI(+)meansthecompoundsfoundbypositiveionmode；ESI(-)meansthecompoundsfoundbynegativeionmode．Rtmeansretentiontimeofeachmetabolites．-：thecompoundwasundetected．

质谱条件的优化：选择一枝蒿酮酸、芦丁、紫花牡荆素、异槲皮苷、金合欢素、刺槐素、蒙花苷和洋艾素共8种对照品的混合溶液，采用蠕动泵直接进样进行分析，以分子离子峰强度较高为判断标准，最终优化后的条件如下：喷雾电压：3.5 kV(正离子模式)， -3 kV(负离子模式); 鞘气: 0.24 MPa; 辅助气: 0.10 MPa; 离子源温度: 350℃(正离子模式)，380℃(负离子模式)。

3.3 新疆一枝蒿不同组织器官的代谢组学研究

进一步使用SIMCA-P软件对各提取溶剂获得的二维数据阵进行PCA分析，结果如图2所示，正、负离子检测模式下，甲醇-水与甲醇-氯仿-水之间分组不明显，而二者与乙腈-水、乙酸乙酯-水之间分组明显，表明使用甲醇-氯仿-水作为提取溶剂时获得的整体代谢组信息与甲醇-水相似，与乙腈-水、乙酸乙酯-水差异较大，考虑到所采用溶剂的环保性，尽管甲醇-氯仿-水提取的色谱峰数目最多，本研究最终采用甲醇-水(80∶20，V/V)代替甲醇-氯仿-水(60∶20∶20，V/V)作为提取溶剂。

为了获得各组间最大程度的分组，筛选出可靠的差异变量，采用2.5节所述方法进行数据处理，最终筛选到的差异变量数、变化倍数>10的差异变量数如表2所示。结果表明，与相似的新疆一枝蒿代谢组学研究结果[23]相比，本研究建立的LC-MS/MS代谢组学分析方法获得了更多可靠的差异变量及更为全面的成分信息，充分展现了本方法全面、高效、快速的特点。

11月19日，乐视网召开2018年第四次临时股东大会。乐视网财务总监张巍在会上表示，截至9月底，公司面临的有息债务大约为80亿元。

图4 基于新疆一枝蒿不同组织器官获得的(A)UHPLC-(-) ESI-MS数据和(B)UHPLC-(+) ESI-MS数据构建的PCA模型得分图 Fig.4 PCA score plots based on (A) UHPLC-(-) ESI-MS data and (B) UHPLC-(+) ESI-MS data from different organs in Artemisia rupestris L.

洞庭湖生态环境专项整治三年计划明确了水资源配置、水污染防治和水生态修复3大方面，总磷全湖年均值、自然湿地保护比例等15项具体指标。其中，到2020年，污染物入湖总量得到严格控制，入湖河流控制断面水质达到Ⅲ类及以上，洞庭湖水质总磷≤0.1mg/L，其它指标为Ⅲ类；自然湿地保护总面积达到71万公顷，90%以上自然湿地得到良好保护，见表3。

表2 LC-MS/MS代谢组学方法获得的花与根、茎、枝、叶之间的差异代谢物数目

Table 2 Number of differential variables between flower and other organs using LC-MS/MS based metabolomics method

组织器官Organ花FlowerESI(+)差异变量数Numberofdifferentialvariables变化倍数>10的差异变量数Numberofdifferentialvariableswithfoldchange>10ESI(-)差异变量数Numberofdifferentialvariables变化倍数>10的差异变量数Numberofdifferentialvariableswithfoldchange>10根Root2677141925511271茎Stem266510842452906枝Branchlet21401512019137叶Leaf23782002261175∗ESI(+)meansthedifferentialvariablesfoundbypositiveionmode；ESI(-)meansthedifferentialvariablesfoundbynegativeionmode．

进一步根据差异代谢物的高分辨质谱及MS/MS谱数据，结合代谢物数据库Metlin(http://metlin.scripps.edu)检索，对上述组间变化倍数大于10的差异代谢物结构类别进行了分析。以黄酮类化合物为例：黄酮类化合物包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、异黄酮醇、黄烷酮、异黄烷酮和查耳酮等多种苷元结构类型以及黄酮氧苷、碳苷等异构体形式的糖苷类化合物，且质谱裂解行为具有明显规律。比较分析表明[24]，相比于正离子检测模式，黄酮苷类化合物在负离子检测模式下灵敏度更高，其酚羟基失去质子产生[M-H]离子， [M-H]-的(-)ESI-MS/MS谱易丢失糖基产生苷元离子与自由基苷元离子([Y0-H]-·)。 例如，黄酮醇O-糖苷类化合物，B环为单羟基取代时，易产生环为双羟基取代时，易产生采用该方法共分析判别出61个黄酮类化合物。同理，结合其它类化合物的裂解规律[12]与数据库检索，最终判别出97个一枝蒿酮酸衍生物、7个绿原酸类化合物以及15个其它类型化合物。

采用聚类热图对上述180个差异代谢物在不同组织器官的分布情况进行表征。由图5可知，盛花期人工栽培品种新疆一枝蒿中绝大部分黄酮类和绿原酸类化合物在花中含量最高，提示这些化合物可能主要是在花中合成; 绝大部分倍半萜类化合物在花或叶中含量较高，表明花与叶可能是此类化合物的生物合成或积累部位。其中，新疆一枝蒿的特征有效成分“一枝蒿酮酸”在花中含量最高，在叶、枝、茎、根中依次降低，这与文献 [23]的结论一致，该结果也表明本方法的可靠性。新疆一枝蒿为全草入药，黄酮类和倍半萜类化合物是主要活性成分，通过建立的代谢组学分析方法获得的物质分布特征表明，花与叶中其有效成分含量较高，此结果为新疆一枝蒿有效部位的合理利用提供了重要依据。

图5 负离子检测模式下新疆一枝蒿根、茎、叶、枝、花之间差异代谢物的分布热图 Fig.5 Heat map of differential metabolites distributed among different organs of Artemisia rupestris L. in negative ion mode

4 结 论

建立了基于LC-MS/MS技术的新疆一枝蒿代谢组学分析方法。本方法样品前处理操作简便，分析方法稳定性好、灵敏度高、代谢物覆盖范围宽，可高效、全面地获取该植物的代谢组信息。采用本方法对新疆一枝蒿的根、茎、枝、叶、花的代谢组进行分析，发现了不同化学成分及特征活性成分在不同组织器官的分布特征，为新疆一枝蒿有效部位的合理利用提供了重要依据。同时，本研究结果为揭示新疆一枝蒿植物的生理及代谢适应机制提供了关键信息，为药材的质量控制、品种改良和合理开发提供了新的研究策略。

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