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分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿

更新时间:2016-07-05

孔雀石绿(MG)能有效预防和治疗由细菌、真菌和寄生虫引起的鱼病,并且价格低廉,被广泛应用于水产养殖。但孔雀石绿具有高毒性、高残留、高致癌、致突变等危害,被指定为水生生物禁用药物。因此对孔雀石绿的灵敏准确检测十分重要[1 - 2]。目前孔雀石绿的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等[3 - 5]。水产品组织基质复杂,常采用固相萃取(SPE)技术进行前处理,但现有固相萃取填料多为非特异性,处理效果不理想。分子印迹技术可制备对目标分子具有特异识别性的分子印迹聚合物(MIPs),将其做为吸附材料,能选择性分离富集复杂样品中痕量分析物,有效去除基质干扰,进而提高分析的准确度和灵敏度[6 - 8]

近几年,制备孔雀石绿印迹材料用于检测水产品的相关文献已有报道。You等[9]制备孔雀石绿磁性印迹材料,结合超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)法对鱼肉中孔雀石绿残留进行分析。张建清[10]等采用原位聚合法制备孔雀石绿印迹检测板,结合化学发光免疫分析法对海参、扇贝和蚬子中的孔雀石绿进行分离富集。沉淀聚合法制备MIPs,具有操作简单,聚合物表面洁净,吸附量高的优点。本文以孔雀石绿为模板分子,采用沉淀聚合法制备MIPs。将制得吸附容量更高的聚合物作为分离介质,自制固相萃取小柱,通过优化淋洗、洗脱条件,建立分子印迹固相萃取-高效液相色谱法,对水产品孔雀石绿残留进行分析,获得较好结果。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

P230型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)。

孔雀石绿(MG)、隐性孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐性结晶紫(LCV)标准品(阿拉丁试剂有限公司);正己烷、氯仿、丙酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)(分析纯,东京化成工业株式会社);偶氮二异丁腈(AIBN)(分析纯,北京化工厂);α -甲基丙烯酸(MAA)、乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、冰乙酸、乙酸铵,均为色谱纯。实验用水为去离子水。

称取1 mg MG标准品,置于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,得0.01 mg/mL标准储备液。然后取1 mL MG标准储备液于1 000 mL容量瓶中,以乙腈定容,配成0.01 μg/mL MG标准储备溶液。

1.2 MIPs的制备

鱼,虾,贝类去鳞,去壳,取肌肉部分,粉碎备用。称取5.0 g样品于50 mL离心管中,加入20 mL乙腈-乙酸盐缓冲溶液,1 000 r/min匀浆提取30 s振荡2 min,加5 g 酸性Al2O3,400 r/min离心10 min,取上层清液于100 mL分液漏斗,残渣加入20 mL乙腈-乙酸盐缓冲溶液,3 mL 盐酸羟胺溶液,5 mL 对-甲苯磺酸溶液,振荡2 min,400 r/min离心10 min,合并提取液,400 r/min离心10 min,45 ℃ 旋蒸近干,备用。

1.3 分子印迹固相萃取(MISPE)柱的制备及萃取条件优化

此外,在“寻根之旅”夏(冬)令营中,展开多种形式的文化活动,如“汉语演讲”“汉语知识竞赛”“中文话剧”“华文卡拉OK比赛”等,对于海外华文教育的普及也具有辅助作用。

1.4 样品预处理

取模板分子MG 0.1824 g (0.5 mmol)溶于40 mL甲醇/乙腈(1∶1,V/V)溶液中,加入功能单体MAA 0.95 mL(1.5 mmol),室温静置12 h后,加入交联剂EDMA 1.41 mL (12 mmol),引发剂AIBN 30 mg,超声溶解,通氮除氧15 min,密封。60 ℃水浴聚合24 h,抽滤,冷却到室温,干燥,得到聚合物。用甲醇-乙酸(9∶1,V/V) 为洗脱液进行索氏提取,直到洗脱液无色,真空干燥,得到MIPs。不加入模板分子,重复上述实验步骤,制备非印迹聚合物NIPs。

色谱柱:SinoChrom-BP ODS柱(200×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-乙酸铵缓冲溶液(pH=4.5)(80∶20,V/V),使用前经0.45 μm滤膜抽滤装置脱气;紫外检测波长为618 nm,进样量为15 μL,流速为0.8 mL/min。

本报讯继广东、广西、云南之后,四川成为柑橘种植新的风口。据悉,短短3年时间,四川省柑橘扩种面积高达200万亩,并保持每年60余万亩的增速,2017年四川柑橘种植面积突破了600万亩。但是在四川柑橘种植业繁荣发展的背后,也隐藏不少产区痛点问题,如因长期不合理施肥而导致的土壤酸化和土壤板结,因施肥理念较为落后而导致肥料利用率过低、产量大小年等等。这些问题不仅仅影响着广大种植户的收益,更是制约着整个四川柑橘产业的可持续发展。

MISPE柱依次用5 mL 乙腈和5 mL去离子水活化,在优化条件下对样品进行净化。

1.5 HPLC条件

将碱性氧化铝柱安装在固相萃取装置上,用5 mL乙腈和5 mL去离子水活化。甲醇-乙酸溶液洗脱萃取柱,洗脱液过0.45 μm有机过滤膜,HPLC法测定。

2 结果与讨论

2.1 聚合物的吸附性能

4.1 产地选择 临沭地瓜生产区域共涉及临沭县境内9个镇(街道办事处)的地瓜生产村。选择旱能浇、涝能排,土壤条件良好、灌溉水无污染,远离厂矿企业的地块种植地瓜,产地环境质量符合国家卫生标准。

图1 静态吸附曲线及拟合模型 Fig.1 Static adsorption curve and the fitting model a.Static adsorption curve;b.Freundlich model of MIPs;c.Langmuir model of NIPs.

MIPs和NIPs的静态吸附数据采用Freundlich模型和Langmuir模型拟合,结果如表1所示。MIPs的Freundlich吸附方程的线性相关系数R2为0.9956,与Langmuir方程相比具有更好的线性关系。因此,MIPs对MG的吸附更倾向于多分子层吸附,结合位点是非均一性的,而NIPs符合Langmuir模型,属于单分子层吸附。

表1 吸附等温模型参数

Table 1 Adsorption isotherm parameters

ModelpolymerQe(mg/g)ModelcategoryLinearequationCorrelationcoefficient(R2)MIPs4.69Langmuiry=0.5958x+4.92670.9331Freundlichy=0.6522x-0.99230.9956NIPs1.76Langmuiry=0.6132x+1.52310.9971Freundlichy=0.4512x-0.81270.8732

2.1.2 动态吸附 对聚合物动力学吸附性能进行考察(图2a),MIPs在2.5 h达到吸附平衡,而NIPs在1.5 h达到吸附平衡。为进一步探究其吸附过程,对吸附数据进行动力学模型拟合(图2b),由表2相关系数R2可知,MIPs符合准二级动力模型,存在着表面的物理吸附及印迹孔穴的特异性吸附,表面的物理吸附传质阻力小,吸附速率快,属于快吸附过程,而特异性吸附过程中,模板分子进入印迹孔穴时传质阻力增大,吸附速率慢,属于慢吸附过程,而NIPs符合动力学准一级模型,证明只存在表面物理吸附过程,而无特异性吸附。

[13]Prithwis Dutta, Neutralism with Special Reference to India, Burma, Ceylon, Egypt & Ghana, Calcutta: The World Press Private Limited, 1978, p.125.

图2 动力学吸附曲线及拟合模型 Fig.2 Dynamic adsorption curve and the fitting model a.Kinetic curves;b.Pseudo-first-order of MIPs and NIPs;c.Pseudo-second-order of MIPs and NIPs. 表2 准一级动力学方程和准二级动力学方程拟合参数 Table 2 Pseudo-first-order and pseudo-second-order parameters

PolymerPseudo-first-ordermodelPseudo-second-ordermodelk1/(h-1)Q1/(mg/g)R2k2/(g/(mg·h)Q2/(mg/g)R2MIPs1.95516.860.92349.095.180.9897NIPs2.8065.7520.99182.921.690.8297

2.2 MISPE固相萃取条件优化

2.2.1 淋洗溶剂条件优化 考察乙腈、甲醇、正己烷、氯仿、丙酮作为淋洗溶剂时,对洗脱率的影响。结果显示,乙腈、甲醇、氯仿、丙酮为淋洗液时,在MISPE柱中MG检出量均大于20%,在NISPE柱中MG检出量均大于60%,说明这些溶剂在除去杂质和干扰物的同时损失大量目标化合物,因此不能做为淋洗液。而以正己烷为淋洗剂时,在MISPE柱上MG检出量为7.1%,在NISPE柱上MG检出量为21.2%,原因是正己烷极性弱于其他4种溶剂,对模板与印迹孔穴之间氢键破坏程度最小,因此后续实验以正己烷为淋洗液。

2.2.2 洗脱溶剂条件优化 参照相关文献报道[11 - 13],选择甲醇/乙酸,甲醇/水,乙腈/水作为洗脱溶剂,结果见图3。当以甲醇/乙酸为洗脱液时,回收率最大为98.7%,原因是MG 在甲醇中有很好的溶解性,加入乙酸后,乙酸的羧基易与模板分子之间形成氢键,从而破坏功能单体与模板之间的作用力,减少MG残留,确保洗脱完全。由图中还可见,洗脱液体积为4 mL时,回收率达到最大且平衡,因此确实洗脱液体积为4 mL。

Measurement of 25(OH)D level is the highly indi-cative for overall vitamin D status. 25(OH)D accounts for sunlight exposure, dietary intake and conversion from adipose tissue[3,6,7]. Vitamin D de fi ciency (VDd) is de fi ned as 25(OH)D < 15-20 mg/dL and suf fi cient range> 30 mg/dL.

2.2.3 印迹柱的性能评价 为考察MISPE柱对MG选择性吸附能力,选择与MG结构类似的隐性孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐性结晶紫(LCV)为对照物,考察它们在MISPE柱和碱性Al2O3柱上的吸附容量,结果见图4。MISPE柱对模板MG吸附容量为4.78 mg/g,高于其它3种结构类似的水产药物,这说明MISPE柱对孔雀石绿有良好的特异性吸附能力;Al2O3柱对4种分析物的吸附容量十分相近,其吸附作用是非特异性的,且对于MG的吸附容量与MISPE柱有明显差距。

现实生活中,部分子宫畸形患者能生育且无临床症状,不需处理;当畸形影响生活及生育时才需手术治疗。手术治疗主要是为了改善子宫畸形患者的临床症状和生殖预后。随着科学技术不断发展,子宫畸形的诊断治疗水平也不断提高。宫腔镜及腹腔镜下的子宫畸形矫治手术因手术创伤小、术后恢复快、住院时间短、再次妊娠所需间短等优势,普遍应用于子宫畸形的治疗,成为子宫畸形治疗的一线选择。此外,超声及腹腔镜监测技术在宫腔镜手术中的应用可以再次明确诊断,提高手术安全性,弥补宫腔镜手术的局限性。对畸形子宫的处理应强调个体化,选取最优的子宫畸形治疗方式。

图3 洗脱液对回收率的影响 Fig.3 Effect of eluent on the recoveries of MG

图4 MISPE柱和碱性Al2O3柱对其结构相似物的吸附容量 Fig.4 Adsorption capacity of vanillin and its analogues on MISPE and Al2O3 column

2.3 水产品中孔雀石绿的检测

2.3.1 线性范围与检出限 实验以空白鲫鱼基质提取液稀释标准MG储备溶液,配制浓度为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、2.5、5.0 μg/mL的MG标准工作溶液,进行MISPE-HPLC方法分析,以MG浓度(x,μg/mL)为横坐标,以峰面积(y)为纵坐标,得到的线性关系为:y=70 324x-1 004.3,R2>0.999,在0.01~5.0 μg/mL范围内线性关系良好。通过对7种空白样品进行加标实验,以大于3倍信噪比(S/N)作为检出限,求得检出限为2.01×10-3 μg/mL,以大于10倍信噪比(S/N)作为定量限,计算得定量限为6.7×10-3 μg/mL。

图5 鲫鱼样品色谱图 Fig.5 Chromatograms of crucian carp sample a.Crucian carp sample without extraction;b.Extration by alkaline Al2O3 column;c.Extration by MISPE column.

系统运行时,根据采集的数据信息和外部调度命令,运行控制系统调用事先编好的逻辑控制程序,针对实时信息,执行小区域协调控制;底层设备根据实时参数,和事先写入的逻辑控制程序,执行单个设备的控制。

2.3.3 色谱行为 分别以 MISPE柱和目前国家标准中常使用的碱性Al2O3柱,对加标的小龙虾肌肉样品中的MG进行分离富集,结合HPLC法分析,其色谱图见图5。经 MISPE和碱性Al2O3柱处理后,均有效去除了基质干扰,但MISPE柱富集倍数更高,去除杂质效果更好。这是因为 MISPE柱的印迹填料内存在与 MG结构匹配的记忆孔穴,对 MG显示出高选择性,这正是分子印迹聚合物的特点所在。

329 HPLC-TOF/MS 快速鉴别相思藤中的化学成分 付振贺,黄玉凤,黄超君,谢从景,吕 磊,杜红丽,赵 亮,焦 杨

称取100 mg MIPs粉末均匀填入聚丙烯固相萃取(SPE)小柱中,在SPE柱底部和聚合物上方加入聚乙烯筛板,轻轻敲打使其紧实。先用5 mL乙腈和5 mL去离子水平衡SPE柱,然后将配制好的MG标准溶液过柱,考察淋洗、洗脱液条件对MISPE 小柱保留性能的影响,洗脱液干燥,溶解在流动相,HPLC法测定。

3 结论

以MG 为模板分子,MAA为功能单体,采用沉淀聚合法,制备了 MG分子印迹固相萃取填料。在MISPE优化条件下,应用于水产品中 MG检测的样品净化。结果表明,MISPE 萃取效果优于传统碱性Al2O3 柱,表现出对MG优异的净化效果和富集能力,为富集水产品中MG残留,提供了新材料。

参考文献

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[2] NY 5071-2002.The Pollution-Free Food Standards-Fishing with Drug Use(无公害食品-渔用药物使用准则).

2.1.1 静态吸附 在温度25 ℃下,MIPs和 NIPs对MG的吸附等温线见图1a。随着MG初始浓度的增加,MIPs和NIPs对MG的吸附容量(Q)随之增加。相同浓度下,MIPs中由于存在与MG相匹配的印迹孔穴,吸附容量远大于NIPs。当MG浓度为45 μg/mL时,吸附达到饱和,MIPs的最大吸附容量达到 4.69 mg/g,高于现有方法[9 - 10]

[3] SU L Q,WANG L B,ZHANG H J,et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(苏立强,王丽博,张慧洁,等.分析试验室),2017,36(08):938.

2.3.2 准确度与精密度 分别在鲫鱼,鲶鱼,黄花鱼,小龙虾,基围虾,扇贝,生蚝7种水产空白样品进行加标回收实验,加入1.0、1.5、2.0 μg/mL 3个浓度水平MG溶液,测定准确度和精密度。MG加标回收率范围为81.2%~101.6%,相对标准偏差(RSD)范围为1.7%~5.4%,优于国家标准方法[11]

[4] WU L,LIN Z Z,ZHONG H P,et al.Sensors & Amp;Actuators:B Chemical,2017,239:166.

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[9] YOU X X,GAO L,QIN D L,et al.Journal of Separation Science,2017,2:227.

在黎永兰出事之后,黎永兰的父母就林雪川借款一事将他告上了法庭,仅经过法院确认的向黎家借款的金额就有146.5万。李玉说,这146.5万还是有凭据的并通过法院确认了的,剩下的还有许多借款连收据都没有。

[10] ZHANG J Q, LI M,ZHANG S,et al.Chemistry Bulletin(张建清,李明,张思,等.化学通报),2016,79(4):366.

(2)专业合作社连接型。即“公司+专业合作社+农户”型发展模式,以专业合作社为中介,对内组织农户按区域进行农产品生产,对外与农产品加工、营销龙头企业连接。

[11] XIANG H,TAN L,YUAN S L,et al.Journal of Analytical Science(向辉,谭利,袁丝兰,等.分析科学学报),2017,33(4):527.

[12] SC/T 3021-2004.The Determination of Malachite Green Residues in Aquatic Products-Liquid Chromatography(HPLC)(水产品中孔雀石绿残留量的测定-液相色谱法).

[13] YU F,PAN L S,LIU Y J,et al.Journal of Analytical Science(喻锋,潘浪胜,刘跃进,等.分析科学学报),2017,33(4):493.

王丽博,苏立强,韩超男,吕艳荣
《分析科学学报》 2018年第02期
《分析科学学报》2018年第02期文献

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