腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是在头颈部常见的恶性肿瘤，好发于涎腺，以发生在腭腺者居多。肿瘤易沿神经扩散和远处转移，影响患者预后[1]。ACC的治疗目前是以手术为基础的综合治疗，术后辅以化疗，常用药物有：甲氨蝶呤、阿霉素、氟尿嘧啶、紫杉醇、顺铂等，肿瘤对药物应答率低，效果并不理想。有研究表明，大蒜素可抑制多种肿瘤的生长，且可与多种抗癌药物产生协同效应[2-4]。自2016年1月至2017年1月，本研究通过建立人ACC-M 细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型，研究大蒜素与顺铂联用对ACC的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物 人涎腺ACC-M细胞株购于武汉大学保藏中心，大蒜素、顺铂、小牛血清、RPMI-1640培养基购于广州皖冬生物科技有限公司，Balb/c裸鼠由华阜康生物公司提供，24只雌性裸鼠，均为5～6周龄，体重(18±2)g，健康状况良好。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 24只裸鼠，分实验组[大蒜素组、顺铂组和联合组(大蒜素加顺铂)各6只]18只和对照组6只。

1.2.2 细胞培养与造模 ACC-M细胞在含有100 U/mL青霉素、链霉素及10%小牛血清的RPMI-1640完全培养液中，置于37℃、CO2含量为5%的培养箱中培养。离心收集对数期细胞，用PBS重悬制成细胞悬液，浓度为约2×107·mL-1，每只裸鼠于右侧前肩胛区皮下接种细胞悬液0.2 mL建立移植瘤模型。

1.2.3 给药及测量移植瘤体积 接种肿瘤细胞2周后腹腔注射药物，实验组(大蒜素组、顺铂组、联合组)的大蒜素和顺铂溶液均为20 μg/mL，根据裸鼠体重给药0.01 mL/g，对照组予0.9%PBS，1次/2 d，共3次。注射药物前、注射药物后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d共6次测量移植瘤瘤体的长径和短径，计算体积(tumor volume，TV) =长径×短径2/2。实验过程中观察裸鼠生存情况。

1.2.4 病理学技术 给药第10天颈椎脱臼法处死裸鼠，完整取出瘤组织块。用4%多聚甲醛固定标本24 h，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色后，将切片置于显微镜下观察形态学改变。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。数据采用表示，组间比较采用方差分析及Tukey法，校验水准α=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠成瘤及生长状况 裸鼠经右侧前肩胛区皮下接种ACC-M细胞，2周后移植瘤成瘤率为 100%，实验过程中24只裸鼠均无死亡，饮食、睡眠无明显异常。

2.2 移植瘤体积比较结果 裸鼠移植瘤造模后2周，药物作用前各组移植瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药后第2天移植瘤体积，联合组、顺铂组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，大蒜素组与对照组、顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05)，联合组与顺铂组差异无统计学意义(P>0.05)，但联合组与大蒜素组差异有统计学意义(P<0.05)。给药后第4天移植瘤体积，联合组、顺铂组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，大蒜素组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，顺铂组、联合组与大蒜素组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但联合组与顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药后第6、8、10天移植瘤体积，大蒜素组、顺铂组、联合组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，顺铂组、联合组与大蒜素组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

 

表1 裸鼠移植瘤的体积比较

  

组别n0d2d4d对照组647.64±7.42102.88±18.26221.04±28.86大蒜素组656.59±10.4191.82±13.97182.28±33.61顺铂组656.55±12.4477.69±14.17*124.24±29.95*△联合组656.34±4.5068.50±6.75*△88.68±6.96*△组别n6d8d10d对照组6394.57±55.35604.41±83.24925.87±142.26大蒜素组6288.58±54.24*389.73±73.29*551.57±105.37*顺铂组6165.52±33.30*△209.73±43.31*△262.02±54.73*△联合组6104.26±7.72*△114.32±8.04*△146.10±10.82*△

 

*与对照组比较P<0.05；△与大蒜素组比较P<0.05

2.3 HE 染色瘤体形态学改变 肉眼观察：瘤体组织外表形态大体呈圆球形或呈结节状，质地硬，切开剖面呈色灰白或淡黄色。HE染色显示：对照组移植瘤内肿瘤组织形态学实质多于间质，肿瘤细胞分布密集，生长旺盛，核异型率高(图1-A)。大蒜素组肿瘤细胞数量较对照组少，可见部分坏死区域(图1-B)。顺铂组已无肿瘤细胞的腺管样结构的典型特征，且肿瘤组织大量坏死，部分核质增大，部分核固缩(图1-C)。联合组可见肿瘤组织大片坏死，新生纤维结缔组织长入，肿瘤细胞数明显减少，部分可见空泡样性变(图1-D)。

  

A:对照组;B:大蒜素组;C:顺铂组;D:联合组

 

图1 各组移植瘤的形态学变化(HE,×200)

3 讨论

ACC曾用名“圆柱瘤”，恶性程度较高，侵袭性强，且好发于头颈部，临近重要器官，给医生手术带来较大困难。因其不容易被患者发现，常常就诊时已到晚期，造成患者严重的身心创伤。手术治疗为主，根据患者病情选择性予以放化疗是当前临床治疗的常见方式。顺铂是治疗人ACC的常用化疗药物，但因应答率不高及严重的不良反应，致使ACC患者出现较高的病死率。当前ACC的转移及发病机制尚在探索之中，加上其对于抗癌药物的低敏感性和较强的耐药性，导致其临床治疗存在一定的困难，因此目前临床医生迫切需要一种新的有效治疗方法。

大量研究表明大蒜具有良好的防癌抗癌作用，而大蒜素是单子叶百合属植物蒜的鳞茎大蒜籽提取物，其含有多种含硫化合物，具有杀菌、防癌、抗癌等作用[2-5]。叶克等[6] 研究发现大蒜油可降低黑素瘤B16细胞血管内皮生长因子的表达，同时使mRNA和蛋白质的表达降低，以此发挥对黑素瘤B16细胞的抑制作用。Tao等[7]将大蒜素作用于人胃癌SGC-7901细胞，使用流式细胞技术和MTT实验测定抑制率，实验证明大蒜素对人胃癌SGC-7901细胞的抑制效果较其他化疗药物更好，而毒性不良反应相对较小。Hassan等[8]研究表明大蒜素可增强癌细胞Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9蛋白的表达, 从而诱导癌细胞核固缩和凋亡小体的形成, 从而增强化疗药物诱导凋亡的作用。顺铂是一种广谱抗癌药物，可损伤肿瘤细胞膜结构，阻断核苷酸复制，对肿瘤细胞有较强毒性。临床上头颈部鳞癌、肺癌、卵巢癌、鼻咽癌及ACC等多种肿瘤使用顺铂治疗均能显示疗效。但作为化疗药物如果长期大量应用, 仍会引起严重的不良反应, 且可导致癌细胞对其产生耐药反应。所以目前迫切需要探索一些具有一定抗癌作用，或可以协同常规化疗药，并可降低其毒性不良反应的药物应用于临床[9-10]。梁笑倾等[11] 研究发现大蒜素可上调Bax，下调Bcl-2蛋白表达来发挥对人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV-3/DDP的抑制增殖和促凋亡的作用，其诱导凋亡作用较顺铂更强，二者合用时可发挥协同作用。Nasr等[12]研究老年大蒜提取物防止顺铂治疗的成年雄性大鼠中的氧化应激和肾脏变化，发现老年大蒜提取物通过其抗氧化，抗炎和抗细胞凋亡性质，具有对顺铂诱导的成年雄性大鼠氧化应激和肾损伤的改善作用。周生财等[13] 使用顺铂、大蒜素治疗大鼠膀胱癌，发现两者合用时不仅能起到诱导膀胱癌细胞凋亡的协同效应，而且可提高大鼠的存活率。黄鉴等[14]使用大蒜素和奥沙利铂作用于体外培养的大肠癌细胞HCT-8，发现联合用药组HCT-8组细胞生长抑制率明显高于单独用药组和对照组， 因此两者联用可有协同作用。樊治英等[15] 实验使用大蒜油联合顺铂作用于体外培养的ACC-M细胞，发现大蒜油可将ACC-M细胞阻滞于G2/M 期，并诱导其凋亡，两种药物联用时效果更显著。

如图3为室温下(20 ℃),TLS输出的SP光波长为1 550 nm,SP光功率为0.5 mW当980泵浦功率达到33 WM时,图3所示测试系统的多波长光纤激光器产生第1阶stokes光,stokes光频移vB为0.084 nm。

聚类分析算法在内部审计涉及数据分析与挖掘方面都可能用到，传统的内部审计的分析都是通过Excel、SQL等方式进行分析，对于复杂且数据量大的数据分析过程会变得相对复杂，而使用R语言实现的聚类分析能够快速高效地得出分析结果。为审计人员提供了直接、高效的审计依据。本文主要是针对大工业用电的电费与电量进行分析，证明算法的简单、高效与实用性强，但只考虑了接近高斯分布类型的数据，在实际应用中，会涉及不同的数据类型，有很多针对不同数据类型的改进算法，需要进一步研究。

本研究通过裸鼠造模，腹腔给药，测量肿瘤体积变化和观察肿瘤的形态学改变，探讨大蒜素加顺铂联合应用对ACC的抑制作用，结果表明大蒜素、顺铂、大蒜素加顺铂对裸鼠体内ACC-M细胞移植瘤的增殖均有明显的抑制作用，但三者药物对移植瘤作用只是肿瘤的体积生长较对照组减缓，而无肿瘤的体积明显缩小，这说明ACC对大蒜素、顺铂、大蒜素加顺铂的应答率低，该类药物单一化疗对ACC的治疗效果欠佳，只能用于ACC联合治疗的辅助用药。大蒜素联合顺铂使用对ACC移植瘤的抑制作用较单用大蒜素、顺铂更强，这说明大蒜素可以增强顺铂对ACC的抗癌作用，发挥一定的协同作用，具体机制有待进一步研究。

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