乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起乙型肝炎严重危险人类健康。肝纤维化是乙型病毒肝炎患者转慢性肝炎后进展成肝硬化甚至肝癌的重要阶段。早期诊断乙型肝炎患者肝纤维化对于控制乙型肝炎的进展及改善预后具有重要意义。目前诊断肝纤维化的金标准是肝脏穿刺活检[1]。这种方法对患者身体损伤较大，患者适从性较差。因此近年探索较高灵敏度和特异性的无创肝纤维化检测指标成为研究热点。miRNA122是肝脏特异性表达的一类微小RNA，研究表明miRNA122可调控肝细胞的生长周期、脂质和胆固醇代谢等重要的肝脏生理功能，在肝脏急慢性损伤、肝硬化、酒精性肝炎、肝脏肿瘤等多种肝脏疾病的发生发展中发挥作用[2]。研究发现不同病因肝损伤患者外周血miRNA122均有不同程度的变化[3-4]。但不同肝纤维化程度乙肝患者血清miRNA122表达是否也发生变化，是否能作为肝纤维化预测指标尚存争议。因此，本研究拟通过检测血清miRNA122在乙型病毒肝炎及晚期肝纤维化患者中的表达，对血清miRNA122在无创诊断肝纤维化程度的预测价值的进行评价。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2014年3月至2016年6月在宝鸡市人民医院进行肝穿刺活检的HBV感染乙型肝炎患者320例。纳入标准：所有患者诊断参照2010年中国慢性乙型肝炎防治指南[5]；乙型肝炎表面抗原阳性＞6个月；总胆红素水平正常，谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）＜400 U/L；肝穿刺检查前1年内未接受各种抗病毒药物治疗。排除标准：排除其他嗜肝病毒感染、酒精性肝病、各种类型的脂肪肝、自身免疫性肝脏疾病或其他因素引起的肝功能异常患者；排除严重的心、肺、肾疾病，风湿免疫系统疾病，糖尿病、甲亢等代谢病、合并HIV感染、Wilson病等患者。320例患者中男219例，女101例，年龄21～75岁，平均（35.3±12.6）岁。另外，选择健康者310例（对照组），男192例，女118例，年龄20～70岁，平均（37.5±12.5）岁。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用x2检验，计量资料采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义[3] 。

1.2 研究方法

1.2.1 血清学检查：所有患者在肝穿刺检查当天早晨空腹采血送检验科检查相关指标[ALT、AST、HBV DNA、乙肝五项、血小板计数（platelet count，PLT）、白蛋白（Albumin，ALB）、谷氨酰转肽酶（γglutamyl transpeptadas，GGT）等]。用ALT、AST、PLT值计算FIB-4[6]和APRI[7]指数。取部分静脉血3 500 r/min离心5 min，取血清于-80 ℃保存。

1.2.2 肝脏活组织检查和病理诊断：在彩色多普勒超声引导下采用16 G穿刺针进行一秒钟快速穿刺活检术穿刺获取长度为1.5～2.0 cm的肝脏组织。肝组织获取后立即甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，经HE染色及网状纤维和（或）Masson三色染色后观察，分别由三名病理医师进行独立阅片诊断。肝脏炎症活动度分级（G）和纤维化分期（S）参照2000年病毒性肝炎防治方案[8]。

认知属于机体认识以及获取知识的智能加工过程，常出现在学习、记忆、思维、情感等行为中，而认知障碍主要是指机体认识以及获取知识的智能加工过程出现异常，导致机体出现学习、记忆、思维、情感等行为障碍，部分患者同时伴有失语、失认等病理改变。换言之，当机体的认知功能出现问题时，其思维、情感、意志等会出现一系列变化，且有研究证实，认知功能缺陷者常伴有特殊的个性特征，如内向、好幻想、敏感、孤僻、思维缺乏逻辑性等。

1.2.3 血清miRNA122提取及检测[9]：采用miRNeasy Mini Kit（Qiagen公司）提取血清microRNA。Taqman microRNA reverse Transcription Kit（Thermo Fisher公司）和miRNA特异性茎环引物（Applied Biosystems公司）逆转录microRNA。采用Taqman mircoRNA assay（Applied Biosystems公司，包含探针）以U6 RNA作为内参，扩增miRNA-122。采用2-ΔΔCt相对定量法计算miRNA122相对表达量。

1.3 统计学分析

健康对照者与不同肝纤维化程度的乙肝患者血清miRNA-122比较具有统计学差异（F=161.0，P＜0.001），图1。健康对照者（1.00±0.09）显著低于S0-1（4.76±1.13，t=21.52，P＜0.001）、S2（3.97±0.85，t=22.43，P＜0.001）、S3（2.83±0.56，t=20.72，P＜0.001）和S4（2.48±0.41，t=22.34，P＜0.001）组乙肝患者。不同肝纤维化程度的乙肝患者血清miRNA-122比较具有统计学差异（F=46.20，P＜0.001），其中S0-1组乙肝患者血清miRNA-122显著高于S2（t=2.988，P=0.004）、S3（t=7.561，P＜0.001）和S4（t=11.20，P＜0.001）组。S2组乙肝患者血清miRNA-122显著高于S3（t=5.497，P＜0.001）和S4（t=9.101，P＜0.001）组。

2 结果

2.1 乙肝患者肝纤维化程度临床指标比较

320例乙肝患者根据纤维化程度分组：纤维化组（S0-1+S2，n=180）和晚期纤维化组（S3+S4，n=140）。多因素logsitic回归分析发现，AST、HBV-DNA、ALB、PLT、FIB-4、APRI、miRNA-122是晚期肝纤维化的独立风险因素。

320例乙肝患者根据纤维化程度进行不同层次分组：纤维化组（≥S0-1，n=320）、显著纤维化组（≥S2，n=222）、晚期纤维化组（≥S3，n=140）和肝硬化组（S4，n=74）。ROC分析表明血清miRNA-122对不同肝纤维化程度乙肝患者的预测价值能效较好（P＜0.05），尤其是晚期纤维化组和肝硬化组能效更佳（AUC＞0.700，敏感性和特异性均＞70%，P＜0.05），表3和图2。

相关性分析表明血清miR122与肝纤维化分期（S0，1，2，3，4）呈负相关（r=-0.328，P=0.033），与ALT（r=0.132，P=0.142）、AST（r=0.105，P=0.365）、HBVDNA（r=0.221，P=0.098）、ALB（r=0.128，P=0.103）、GGT（r=0.029，P=0.213）、PLT（r=0.052，P=0.125）、APRI指数（r=0.025，P=0.081）、FIB-4指数（r=0.038，P=0.073）无明显相关性。

2.2 不同肝纤维化程度乙肝患者血清miRNA-122的表达

采用SPSS 17.0和Graphpad prism 5.0软件对数据进行统计分析和作图。计量资料采用（±s）表示，计量资料均呈正态分布，两组间比较采用Student's t检验，多组间比较应用方差分析，多组间两两比较采用Bonferroni多重比较检验，相关性采用Pearson相关分析；计数资料组间比较采用χ2检验。ROC分析血清miRNA-122在乙肝患者肝纤维化程度中的预测价值。P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 不同纤维化分期乙肝患者临床指标比较

临床参数 S0-1（n=98） S2（n=82） S3（n=66） S4（n=74） F值 P值年龄（岁） 32.30±11.6 34.50±10.5 36.50±11.2 37.50±10.10 11.706 0.081性别（男/女） （例）71/2762/2044/2242/327.453 0.059 HBeAg（+/-） （例）62/3043/3932/3438/367.410 0.060 ALT（U/L） 58.11±23.11 71.25±35.34 84.95±36.24 82.01±32.58 5.183 0.002 AST（U/L） 47.25±21.33 52.31±31.25 65.88±40.69 63.27±38.24 3.714 0.001 HBV-DNA（Log copies/mL） 6.12±1.62 5.62±1.23 5.41±1.11 5.39±1.06 3.657 0.001 ALB（g/L） 41.98±4.20 41.12±4.12 39.10±4.23 36.81±4.65 12.360 0.009 GGT（U/L） 28.61±12.15 42.52±22.23 54.45±24.13 65.54±26.30 18.350 ＜0.001 PLT（109/L） 172.60±59.60 155.50±52.30 135.40±58.70 112.60±51.80 20.010 ＜0.001 APRI指数 1.21±0.53 1.89±0.54 2.28±0.93 3.11±0.85 32.210 ＜0.001 FIB-4指数 0.59±0.30 1.01±0.42 1.28±0.56 1.48±0.62 21.350 ＜0.001

2.3 乙肝患者血清miRNA-122与临床指标的相关性

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从表1可以看出,制备的NiCr薄膜电阻的偏差值在1%～11%的范围内。其中,线宽为100 μm,方阻数为2的NiCr薄膜电阻的方阻值与设计方阻值的偏差最小,最接近设计方阻值。

图1 不同肝纤维化程度乙肝患者血清miR122表达水平比较

与健康对照者比：*P＜0.05；与S0-1者比：#P＜0.05；与S2者比：△P＜0.05

2.4 乙肝患者晚期肝纤维化独立风险因素分析

320例乙型肝炎患者肝脏纤维化S0-1者98例，S2者82例，S3者66例，S4者74例。不同纤维化程度乙肝患者临床指标比较见表1，四组ALT、AST、HBVDNA、ALB、GGT、PLT、FIB-4指数和APRI指数具有统计学差异（P＜0.05）。

表2 多因素Logistic回归分析乙肝患者肝纤维化独立风险因素

因素 B S.E. Wald P值 Exp（B） 95%CI ALT 0.009 0.008 1.163 0.281 1.009 0.992～1.027 AST 0.059 0.015 14.715 0.001 1.061 1.029～1.094 HBV-DNA -0.655 0.136 23.146 0.001 0.520 0.398～0.678 ALB -0.077 0.036 13.258 0.001 0.877 0.817～0.941 GGT 0.012 0.007 1.582 0.055 1.022 1.009～1.036 PLT -0.009 0.004 6.198 0.013 0.991 0.985～0.998 FIB-4 0.267 0.103 6.686 0.010 0.766 0.626～0.938 APRI 0.148 0.081 5.441 0.020 1.051 1.008～1.093 miRNA-122 -1.140 0.211 29.239 0.001 0.320 0.212～0.483

2.5 血清miRNA-122在乙肝患者肝纤维化程度中的预测价值

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表3 ROC分析血清miRNA-122对不同肝纤维化程度乙肝患者的预测价值

分组 AUC P值 95%CI 截断值 敏感性（%） 特异性（%）≥S0-1 0.704 0.021 0.541～0.866 3.38 57.8 48.9≥S2 0.693 0.028 0.529～0.857 3.02 66.3 65.1≥S3 0.738 0.007 0.586～0.889 2.62 70.7 81.3 S4 0.743 0.006 0.598～0.887 2.35 88.2 78.2

图2 血清miR122对不同肝纤维化程度乙肝患者的预测价值

3 讨论

肝纤维化是细胞外基质在肝脏过度堆积的慢性炎症过程，是肝病发展为肝硬化的必经阶段。肝纤维化经过有效的治疗可以逆转，及早评估肝纤维化程度对慢性肝病的治疗及预后具有重要的意义。无创诊断肝纤维化是近年肝脏疾病的研究热点。miRNA122是肝脏组织特异性miRNA，占肝脏miRNA的70%，在脂质代谢、肝炎病毒复制、肝纤维化及肝癌形成等病理过程中发挥重要作用。研究发现在病毒性肝炎、药物性肝损伤等病理状态下外周血miRNA122表达有不同程度的升高，并且与肝炎程度呈正相关[10]。此外，在外周血中miRNA表达相对稳定， HBV感染者外周血miRNA122由于可反映肝细胞损伤程度，可能作为诊断肝纤维化的评价指标运用于临床。

miRNA122是一类抗纤维化类循环血miRNA。本研究发现不同肝纤维化程度的乙肝患者血清miRNA122显著高于健康对照组，且随着纤维化程度增加血清miRNA122表达水平下降，说明血清miRNA122可能作为乙肝患者纤维化程度评价指标。多项研究表明随着肝纤维化程度的增加，肝细胞miRNA122表达水平下降[11]。乙肝患者血清miRNA122表达与肝细胞miRNA122表达水平变化一致。李祥云等研究发现免疫耐受期、免疫清除期、非活动期、再活动期慢性乙肝患者外周血miRNA122表达量均明显升高，尤其在免疫耐受期和免疫清除期升高显著[12]。这些结果表明乙肝患者血清miRNA122除了反映肝细胞损伤程度外，还可与疾病进展有关。

本研究发现乙肝患者血清miRNA122与肝纤维化分期（S0，1，2，3，4）呈负相关，与ALT、AST、HBVDNA、ALB、GGT、PLT、APRI指数和FIB-4指数无明显相关性。Waidmann等[13]研究表明，血清miRNA122与ALT、HBV-DNA和HBs Ag呈显著正相关，与本研究结果不一致。血清miRNA122与HBVDNA的相关性一直存在争议。史咏梅等[14]研究表明，HBV感染者循环miRNA122表达水平可能与病毒复制无关，但可作为反映肝脏活动性损伤和组织修复的指标。但是也有研究表明miRNA122与HBV复制有关，在培养的肝细胞中，随着miRNA122表达增加，HBV感染和复制下降；而当HBV感染或复制增多时，miRNA122表达下降，外周血单核淋巴细胞中miRNA122与病毒载量呈负相关[15]。因此，乙肝患者血清miRNA122与HBV-DNA的相关性有待进一步研究。

Nakamura等[6]研究发现低水平的血清miRNA-122对HBV感染肝纤维化晚期患者具有预测价值，说明乙肝患者血清miRNA122表达可反映纤维化程度，尤其是晚期纤维化程度，与本研究一致。再次表明乙肝患者血清miRNA122可用于评估患者纤维化程度。本研究不足之处：（1）乙肝患者肝细胞miRNA122的表达在本研究中未检测，肝细胞miRNA122的表达变化是否与血清miRNA122一致还需进一步证实；（2）血清miRNA122可反映乙肝患者肝纤维化程度，但相关性机制尚未研究，有待进行体内外实验阐明；（3）本研究为单中心研究，今后仍需进一步扩大样本，进行多中心研究。

总之，乙肝患者血清miRNA122可用于评估患者纤维化程度，尤其是晚期纤维化程度。本研究结果有助于揭示miRNA122与HBV感染性疾病的相关性的确切机制，进一步用于临床实践。

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