海洋微生物生存在高压、高盐、低温的特殊环境中，形成了独特的代谢系统和防御机制，能产生许多结构复杂、活性显著的天然产物[1-3]。在过去的几十年中，海洋真菌作为海洋微生物的重要组成部分，其次级代谢产物研究一直是海洋天然产物领域的研究热点，迄今从海洋真菌中分离出了3 000多个新化合物，其中大多数化合物不但具有新颖的结构骨架，而且有显著的药理作用[4-6]。

为了寻找新型的活性天然产物，本课题组从南海沉积物分离得到1株海洋真菌Westerdykella dispersa FS350，对该菌株粗提物的TLC分析，结果表明该菌株的代谢产物丰富。经查阅文献，发现该属真菌的次级代谢产物研究鲜有报道，仅有几篇文献报道从该属真菌分离得到的少数细胞松弛素类化合物，且这些化合物具有显著的抗菌及抗肿瘤等活性[7-8]。因此，Westerdykella属真菌是一类具有潜在开发价值的药用资源。

为了充分发掘该属真菌的活性次级代谢产物，本研究对菌株W. dispersa FS350进行了100 L的液体发酵培养，从发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离得到了8个化合物，分别鉴定为2-(4-羟苯基)乙酸乙酯(1)、3-hydroxy-1-(2,6-dihydroxyphenyl) butan-1-one(2)、4-epiradicinol(3)、3-糠酸(4)、2-(4-羟苯基)-乙醇(5)、对羟基苯乙醇α-羟基丙酸酯(6)、(R)-甲羟戊酸内酯(7)和asterric acid(8)。这是首次从Westerdykella属真菌中分离得到这8个化合物。

王莽史建国三年（公元11年）河水在魏郡元城（今河北大名东）以上决口，洪水泛滥了近六十年，到东汉明帝永平十二年（公元69年），经过王景治河后，出现了一条新河道，即《水经注》以及唐代《元和郡县志》里的黄河。这条黄河已较西汉大河偏东，经今黄河和马颊河之间至利津入海。这条大河稳定了六百多年，其间当然也有多次决口，但无大的改流。直到唐朝末年开始在河口段有部分河段改道。[10]（邹逸麟，1980，黄河下游河道变迁及其影响概述）宋朝初年，棣州（今山东惠民、滨县一带）境内“河势高民屋殆逾丈”。

1 材料、试剂与仪器

1.1 菌株

菌株FS350分离自南海(E:111°1.994′,N:19°20.074′)72 m处的沉积物。通过液氮冻融法提取菌株FS50的基因组DNA，采用引物ITS1扩增其rDNA ITS区，并将反应产物进行了测序。由测序结果可知：菌株FS350与Westerdykella dispersa A1S3-D96(GenBank号：KJ780754)的序列相似度为99%，故鉴定菌株FS350为W. dispersa。菌株保存于广东省微生物研究所。

化合物4：无色油状液体，ESI-MS m/z: 111[M-H]-，分子式为C5H4O3。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) δ: 7.72(1H,d,J=1.7 Hz,H-5),7.20(1H,d,J=3.5 Hz,H-3),6.58(1H,dd,J=3.5,1.7 Hz,H-4)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD) δ: 161.8(C-1),148.0(C-5),146.5(C-2),119.0(C-3),113.0(C-4)。以上波谱数据与文献[14]报道的基本一致，故鉴定化合物4为2-糠酸。

1.2 试剂

发酵液100 L经4层纱布滤过，然后用乙酸乙酯萃取4次，45 ℃下减压浓缩，得到棕红色浸膏27.8 g。浸膏经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯，体积比30∶1→1∶2；二氯甲烷-甲醇，体积比5∶1→1∶1)，用薄层色谱(TLC)检测，合并相似组分，得到14个粗组分(Fr.1～Fr.14)。Fr.4(0.26 g)经反相柱(甲醇-水，体积比30∶70→100∶0)梯度洗脱，得到8个亚组分(Fr.4-1～Fr4-8)；Fr.4-5通过HPLC半制备(乙腈-水，体积比40∶60，3 mL/min)分离得化合物1(4.3 mg)。Fr.7(3.15 g)经凝胶柱(二氯甲烷-甲醇，体积比1∶1)初步划段，得到5个亚组分(Fr.7-1～Fr.7-5)；Fr.7-2经正相硅胶柱(正己烷-异丙醇，体积比30∶1→2∶1)梯度洗脱得Fr.7-2-8；将组分Fr.7-2-8过凝胶柱(二氯甲烷-甲醇，体积比1∶1)，再经反相柱(甲醇-水，体积比20∶80→100∶0)梯度洗脱，获得Fr.7-2-8-1-2和Fr.7-2-8-1-6，这两个亚组分分别用HPLC半制备柱(乙腈-水，体积比30∶70，3 mL/min；乙腈-水，体积比60∶40，3 mL/min)分离得到化合物2(1.9 mg)和3(5.0 mg)。Fr.7-3过反相硅胶柱层析(甲醇-水，体积比40∶60→100∶0)划段，得到Fr.7-3-2和Fr.7-3-5；前者经Sephadex LH-20(丙酮)洗脱，再用正相柱(石油醚-乙酸乙酯，体积比8∶1)纯化得到化合物4(25.0 mg)和5(12.6 mg)；后者通过凝胶柱(丙酮)洗脱、再经HPLC半制备柱(乙腈-水，体积比40∶60，3 mL/min)，分离得到化合物6(20.0 mg)。Fr.8(1.0 g)经凝胶柱(二氯甲烷-甲醇，体积比1∶1)分离，划成3个亚组分(Fr.8-1～Fr.8-3)；将Fr.8-1上反相硅胶柱(甲醇-水，体积比50∶50→100∶0)，得到Fr.8-1-1和Fr.8-1-6。组分Fr.8-1-1用凝胶柱(甲醇)洗脱、再经HPLC半制备柱(乙腈-水，体积比5∶95，3 mL/min)进一步纯化，得到化合物7(6.0 mg)；组分Fr.8-1-6通过HPLC半制备柱(甲醇-水，体积比80∶20，3 mL/min)分离，获得化合物8(3.7 mg)。

1.3 仪器

AVANCE Ⅲ型500 MHz核磁共振波谱仪(Bruker公司)；API 2000 LC/MS/MS质谱仪(MDS SCIEX公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；OSB-2100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；AX224ZH/E电子天平(OHAUS公司)；ZF-7暗箱三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；PZ1000B旋转式大容量普通摇床(武汉瑞华仪器设备有限公司)；超净工作台(上海恒益科技有限公司)。

化合物5：白色针状结晶，ESI-MS m/z: 137[M-H]-，分子式为C8H10O2。1H-NMR(500 MHz,CD3OD) δ: 7.03(2H,d,J=8.5 Hz,H-4,H-8),6.71(2H,d,J=8.5 Hz,H-5,H-7),3.68(2H,t,J=7.2 Hz,H-1),2.71 (2H,t,J=7.2 Hz,H-2)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD) δ: 156.7(C-6),131.0(C-3),130.8(C-4,C-8),116.1(C-5,C-7),64.6(C-1),39.4(C-2)。以上数据与文献[15]报道的基本一致，故鉴定该化合物5为2-(4-羟苯基)-乙醇。

2 方法

2.1 发酵培养

发酵培养基为含海盐的马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，维生素B1 10 mg/L，海盐 15 g/L。

在无菌条件下，将活化后的FS350菌体接种至含PDB培养液的锥形瓶中，在28 ℃、120 r/min条件下振荡培养7 d，共发酵100 L。

2.2 发酵物的提取与分离

柱色谱硅胶(100～200 目、200～300 目，青岛海洋化工厂)；C18反相硅胶(40～75 μm，Fuji Silysia Chemical Ltd.)；凝胶Sephadex LH-20(18～110 μm，Amersham Biosciences Ltd.)；GF254高效薄层硅胶板(Merck公司)；YMC-pack ODS-A column(250 mm×10 mm，5 μm，12 nm，YMC公司)；其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

采用SRB法[9]测定化合物的细胞毒活性。取对数生长期的人肝癌细胞(HepG-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人神经癌细胞(SF-268)和人肺癌细胞(NCI-H460)先用胰酶消化，台盼蓝染色计数；台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95%后，再用新鲜培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，将细胞接种于96孔板，每孔加入细胞悬液180 μL，并设3个空白孔调零，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养24 h。待细胞贴壁后，每孔加入待测样品20 μL，空白对照加培养基20 μL，阳性对照加顺铂20 μL，置CO2培养箱中培养72 h。再加入体积分数50%冷三氯醋酸50 μL固定细胞，4 ℃放置1 h，用蒸馏水洗涤5次；每孔加入SRB溶液(4 mg/mL)100 μL，室温染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后，每孔加入Tris溶液(10 mmol/mL)200 μL，用酶标仪测定570 nm处的吸光度，计算待测样品对肿瘤细胞的抑制率。

2.3 细胞毒活性测试

放下酒杯，富翁说：“我今天和你们说点掏心话，我是个没多大文化的人，当年凭着一股傻劲才把家业干得这么大，所以我要让我的女友在文化上翻身，当作家，当大作家！这本童话怎么出版我不知道，你们帮着弄，钱不成问题。”

2.4 抗氧化活性测试

采用DPPH法[10]测定化合物的抗氧化活性。精确称取一定量的待测化合物和维生素C，用无水乙醇配制成质量浓度为400 μg/mL的溶液，DPPH用无水乙醇配制浓度成0.2 mmol/L的溶液；以无水乙醇溶液作参比溶液，以维生素C溶液作为阳性对照，均向96孔板加入100 μL样品溶液和DPPH溶液，混匀，室温反应30 min后，置全波长酶标仪中517 nm处测量其吸光度，计算待测化合物对DDPH自由基的抑制率。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色油状液体，ESI-MS m/z: 203 [M+Na]+，分子式为C10H12O3。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.08(2H,d,J=8.5 Hz,H-2,H-6),6.77(2H,d,J=8.5 Hz,H-3,H-5),4.24(2H,t,J=14.3,7.1 Hz,H-8),2.86(2H,t,J=14.3,7.1 Hz,H-7),2.04(3H,s,H-10)。13C-NMR (125 MHz,CDCl3) δ: 171.4(CO),154.4(C-1),130.2(C-2,C-6),130.0(C-4),115.5(C-3,C-5),65.4(C-8),34.3(C-7),21.1(C-10)。以上数据与文献[11]报道的基本一致，故鉴定化合物1为2-(4-羟苯基)乙酸乙酯。

化合物2：淡黄色针状结晶，ESI-MS m/z: 219[M+Na]+，分子式为C10H12O4。1H-NMR(500 MHz,CD3OD) δ: 7.26(1H,t,J=8.2 Hz,H-4),6.41(2H,d,J=8.2 Hz,H-3,H-5),4.39(1H,m),3.27(2H,m),1.23(3H,d,J=6.2 Hz)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD) δ: 207.5(CO),163.0(C-2),150.7(C-6),137.1(C-1),111.6(C-4),108.6(C-3,C-5),65.1(C-9),54.2(C-8),23.9(C-10)。经过查阅相关文献，发现该化合物的核磁数据与文献[12]报道的基本一致，故确定化合物2为3-hydroxy-1-(2,6-dihydroxyphenyl)butan-1-one。

化合物6：油状无色样品，(c 1.05,MeOH)，ESI-MS m/z: 233[M+Na]+，分子式为C11H14O4。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) δ: 7.06(2H,d,J=8.6 Hz,H-2,H-6),6.73(2H,d,J=8.6 Hz,H-3,H-5),4.26(2H,m,H-8),4.26(1H,m,H-2′),2.86(2H,t,J=7.0 Hz,H-7),1.32(3H,d,J=6.9 Hz,Me-3′)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD) δ: 176.3(C-1′),157.1(C-4),130.9(C-2,C-6),129.8(C-1),116.2(C-3,C-5),67.8(C-2′),66.8(C-8),35.2(C-7),20.6(Me-3′)。以上数据与文献[16]报道的基本一致，故确定化合物6为对羟基苯乙醇α-羟基丙酸酯。

（1）企业经营结构，主要反映海外资源利用情况，具体指标如：企业发生经营活动的国家的数量、海外子公司的数量或比例、海外资产的总额或比例、海外员工的总数或比例、海外投资者拥有的股份的比例、非资本性投资项目的数量或比例等。

人肝微粒体的制备采用差速离心法［6］，所有操作均在4℃进行。微粒体蛋白浓度以Bradford法并用小牛血清白蛋白作标准对照测定。制备好的肝微粒体分装后于－80℃的冰箱中保存备用。

化合物3：淡黄色固体粉末，ESI-MS m/z: 261[M+Na]+，分子式为C12H14O5。1H-NMR(500 MHz,CD3OD) δ: 6.67(1H,dd,J=15.5,7.0 Hz,H-10),6.13(1H,dd,J=15.5,1.7 Hz,H-9),5.98(1H,s,H-7),4.47(1H,d,J=4.8 Hz,H-3),4.34(1H,ddd,J=6.8,5.5,1.2 Hz,H-5),3.73(1H,dd,J=5.5,4.8 Hz,H-4),1.91(1H,dd,J=7.0,1.7 Hz,Me-11),1.46(3H,d,J=6.8 Hz,Me-12)。13C-NMR(125 MHz,CD3OD) δ: 166.5(CO),165.9(C-6),160.0(C-8),135.8(C-10),124.0(C-9),101.2(C-2),100.5(C-7),78.6(C-5),72.7(C-4),66.4(C-3),18.4(C-11),17.1(C-12)。以上数据与文献[13]报道的基本一致，鉴定化合物3为4-epiradicinol。

化合物7：油状无色液体，分子式为C6H10O3。1H-NMR(500 MHz,CD3OD) δ: 4.54(1H,m,H-6a),4.36(1H,m,H-6b),2.56(2H,m,H-3),1.97(1H,m,H-5a),1.84(1H,m,H-5b),1.33(3H,s,Me-7)。13C-NMR (125 MHz,CD3OD) δ: 173.7(C-2),68.5(C-4),67.6(C-6),45.1(C-3),36.4(C-5),30.2(Me-7)。以上数据与文献[17]报道的基本一致，故鉴定化合物7为(R)-甲羟戊酸内酯。

化合物8:白色针状结晶，mp 201.2～204.3 ℃;ESI-MS m/z 347[M-H]-，分子式为C17H16O8。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 11.18(1H,s,OH-3′),9.89(1H,s,OH-4),6.77(1H,s,H-3),6.77(1H,s,H-5),6.33(1H,s,H-6′),5.65(1H,s,H-4′),3.69(3H,s,OCH3-7),3.61(3H,s,OCH3-9),2.07(3H,s,Me-7′)。13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6) δ: 170.3(C-8′),165.1(C-8),159.8(C-1),158.5(C-1′),155.1(C-4),153.3(C-3′),143.3(C-6),134.0(C-5′),125.3(C-2),109.90(C-4′),107.5(C-3),104.9(C-6′),104.7(C-5),104.1(C-2′),56.1(C-7),52.1(C-9),21.5(C-7′)。以上数据与文献[18]报道的基本一致，鉴定化合物8为asterric acid。

考虑到渗沥液中钙镁硬度较高，受热后容易结垢，塔釜液需及时脱除固体，否则堵塞再沸器，故整体设计中增设高速管式离心沉降机，在此基础上，结合小试结果采用对原水汽提预处理及精馏提氨过程，设计采用汽提-精馏耦合脱氨工艺，设计规模为75 kg/h，效果预期为：塔釜脱氨废水氨氮＜100 mg/L，SS＜600 mg/L，塔顶浓缩氨水含氨＞15%。工艺设计如图3所示。

4 活性测试结果

当浓度为100 μmol/L时，8个化合物对人肝癌细胞(HepG-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人神经癌细胞(SF-268)和人肺癌细胞(NCI-H460)均无明显的细胞毒活性，清除DPPH自由基的能力均很弱。

5 讨论

本文首次从海洋真菌Westerdykella dispersa FS350的发酵产物中分离并鉴定了8个化合物，其中化合物1、2、5和6为苯酚类衍生物，化合物3属于植物毒素，化合物8为二苯醚类化合物。

大豆是否追施氮肥，取决于前期的施肥情况。如果基肥种肥均未施而土壤肥力水平又较低时，可在初花期施少量氮肥，一般每亩施尿素4～5公斤或硝铵5～10公斤，追肥时与大豆植株保持距离10厘米左右。土壤缺磷时在追肥中还应补施磷肥，磷铵是大豆理想的氮磷追肥。在土壤肥力水平较高的地块，不要追施氮肥。

据文献报道，2-(4-羟苯基)乙酸乙酯(1)经常充当药物合成中间体，对前列腺癌细胞(PC-3)具有一定的抑制作用[19]；3-hydroxy-1-(2,6-dihydroxyphenyl) butan-1-one(2)能较为明显地抑制灰葡萄孢菌、燕麦镰刀菌和紧密单孢枝霉菌的生长[12]；4-epiradicinol(3)对大肠埃希菌、猪霍乱沙门菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌具有抑制活性，其最小抑菌质量浓度分别为125、125、62.5、31.8 μg/mL[20]；asterric acid(8)对艾滋病病毒具有一定的抑制活性，当该化合物C-9上的甲氧基还原为羟基时，对艾滋病毒的抑制作用将明显增强，认为C-9的羟基是抑制艾滋病病毒的必需基团[21]。本文的生物活性测试结果显示，分离得到的8个化合物均没有明显的细胞毒和抗氧化活性，但据文献报道部分化合物具有一定的抗菌和抗病毒活性[12,20-21]，今后应进一步测试这些化合物的其他生物活性，以充分发掘它们的药用价值。

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