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瓜子金皂苷提取物UPLC指纹图谱的研究

更新时间:2009-03-28

瓜子金为远志科植物瓜子金(Polygala japonica Houtt.)的干燥全草,其饮片辛、苦、平,归肺经。功能祛痰止咳、活血消肿、解毒止痛,用于咳嗽痰多、咽喉肿痛、外治跌打损伤、疔疮疖肿、蛇虫咬伤[1]。据文献报道,瓜子金的化学成分主要包括皂苷类、黄酮类、有机酸类等[2-3],体外试验表明瓜子金皂苷己对缺血再灌注损伤的神经细胞具有明显的保护作用、抗神经炎症和抗抑郁的作用[2,4-6]

近年来,指纹图谱已广泛应用于中药有效成分识别、中药药性、中药不良反应、中药指纹图谱、中药方剂配伍规律等研究[7]。2015年版《中国药典》收载了三七三醇皂苷、三七总皂苷、丹参总酚酸提取物、丹参酮提取物、莪术油、积雪草总苷、薄荷素油、三七通舒胶囊等共23种物质的指纹图谱[1]

《中国药典》与文献[1,8]均采用高效液相-蒸发光检测法,以瓜子金皂苷己为指标成分进行瓜子金药材的质量分数测定。本文作者在测定瓜子金皂苷提取物的过程中发现蒸发光检测受噪声影响较大、基线不平稳,而紫外检测的结果与蒸发光检测法相当,且得到峰的信息较蒸发光多,因此,本研究以瓜子金皂苷己为考察指标制备得到了瓜子金皂苷提取物,采用高效液相-紫外检测法对瓜子金皂苷提取物进行指纹图谱的初步研究,并进一步进行聚类分析和主成分分析,建立全面控制瓜子金皂苷提取物质量的方法,以期为瓜子金的进一步开发研究提供依据。

1 仪器与试药

Acquity UPLC H-Class 液相色谱仪(美国Waters公司)、Acquity UPLC PDA eλ 检测器(美国Waters公司);Waters 2695 高效液相色谱仪、Waters 2487 紫外检测器、Waters 2420 蒸发光检测器;BS-423S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);UPH-I-20优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司);HWS-26电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);DFT-200手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司);TGL-20B高速离心机(上海安亭科学仪器厂);YH系列电热器(近湖镇教学仪器厂)。

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1 12批瓜子金来源信息表Table 1 Sources of different batches of Polygala japonica Houtt.

  

编号采收地采收日期编号采收地采收日期S1浙江金华2017-02S7浙江金华2016-10S2广西桂林2017-04S8四川绵阳2016-10S3河南洛阳2016-02S9四川遂宁2016-05S4河南南阳2016-05S10四川绵阳2017-05S5河南信阳2017-02S11河南平顶山2016-08S6河南信阳2016-12S12河南南阳2017-05

2 方法与结果

2.1 瓜子金提取物的制备

将不同批次的瓜子金药材粉碎至过50目筛,加入6倍体积的50%(体积分数,下同)乙醇浸泡4 h后,提取2次,每次1 h。将2次提取液混合后,真空减压浓缩除去乙醇。水溶液经HPD826大孔树脂分离纯化后冷冻干燥,得12批提取物,采用香草醛-高氯酸法[9]测得总皂苷质量分数为50.2%~60.6%。

对比瓜子金皂苷己[11]、瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ[12]的结构以及二者的光谱图(见图5)可知,皂苷ⅩⅩⅪ的2个紫外吸收峰230.9、308.0 nm应该来自于图5B中标出的部分,进一步与“B类”物质的光谱图对比,发现二者在230、310 nm左右均有双峰吸收,吸收特征极为类似,因此推测“B类物质”结构或与皂苷ⅩⅩⅪ相似。

瓜子金选自广州清平中药材市场,经广东药科大学刘基柱教授鉴定为远志科植物瓜子金Polygala japonica Houtt.的干燥全草,信息详见表1;瓜子金皂苷己对照品(批号:111921-201102,中国食品药品检定研究院);瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ(南京春秋生物工程有限公司);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);蒸馏水 (屈臣氏);其他试剂均为分析纯。

气压治疗结合神经肌肉电刺激的综合使用将外用加压装置的挤压与电刺激产生的内在肌肉泵效应结合[15],相比于传统单纯的气压和神经肌肉电刺激治疗,可明显加快脑卒中后患手肿胀的消退,改善关节活动度,并能对手肿胀进行早期干预,预防并发症,改善其预后。在实际实施过程中,也具有操作简单易行、适合床边治疗、医疗资源可持续利用等优势,值得在临床推广使用。

2.2 检测方法的选择

2.2.1 色谱条件 色谱柱为JADE-PAK ODS-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~5 min,10%→20%A;5~30 min,20%→30%A;30~60 min,30%→45%A;60~81 min,45%→90%A;81~85 min,90%→10%A);流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:210 nm、230 nm;增益值:10;气体压力:30 psi;喷雾器加热级别:100%;漂移管温度:90 ℃;进样量:10 μL。

2.2.2 供试品溶液的制备 取提取物粉末10 mg,置于10 mL量瓶中,加70%(体积分数,下同)甲醇溶解并稀释至刻度,即得质量浓度为1.0 mg/mL的供试品溶液。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 取瓜子金皂苷己对照品10 mg,置于10 mL量瓶中,加70%甲醇溶解并稀释至刻度,得瓜子金皂苷己储备液。取瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ对照品10 mg,置于10 mL量瓶中,加70%甲醇溶解并稀释至刻度,得瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ储备液。分别取上述储备液各1 mL,加70%甲醇溶解并稀释至5 mL量瓶中,即得(ρ瓜子金皂苷己=0.2 mg/mL、 ρ瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ=0.2 mg/mL)。

2.2.4 检测器及检测波长的确定 将高效液相-蒸发光检测法与高效液相-紫外检测法进行对比,发现2种方法在相同的色谱条件下分析图谱信息等均很相似(见图1与图2e、f),表明瓜子金中皂苷类成分大多连接发色基团,由于高效液相-紫外检测法的稳定性、重现性以及色谱图信息量均较优,最终采取高效液相-紫外检测方法建立瓜子金总皂苷指纹图谱。

载荷的绝对值大小体现对主成分的贡献大小,由表3可知,共有峰19、7、21、4、17、16、15、6、3在A1上有较大的载荷;A2主要来自共有峰14、5、11、9、10、18、20、2、8的贡献;A3主要来自共有峰1、3的贡献;A4主要来自共有峰12、20、6、13的贡献;共有峰8对A5贡献较大。

  

1.瓜子金皂苷己; 2.瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ。

 

图1 瓜子金提取物(S1)的ELSD图谱Figure 1 ELSD chromatogram of extract S1

  

1.瓜子金皂苷己; 2.瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ; a.对照图谱(230 nm; b.对照图谱(210 nm); c. S1药材(210 nm); d. S1药材(230 nm); e. S1提取物(210 nm); f. S1提取物(230 nm)。

 

图2 对照品、S1药材及提取物紫外图谱

 

Figure 2 UV chromatogram of controls,S1,and its extract

2.3 瓜子金总皂苷指纹图谱的建立

2.3.1 UPLC色谱条件 色谱柱为Acquity UPLC® HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色谱柱;流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~20 min,10%→20%A;20~40 min,20%→30%A;40~50 min,30%→45%A;50~62 min,45%→90%A;62~64 min,90%→10%A);流速:0.4 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:230 nm;进样量:10 μL。

2.3.2 溶液的制备 同“2.2.2”项下制备方法。

2.4 方法学考察[10]

2.4.1 精密度试验 取浙江产瓜子金药材粉末(S1)10 mg,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进样6次,以第1次进样所得图谱为对照,导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年A版)”,计算相似度。结果显示6次测定的相似度均为1,符合指纹图谱相关要求(不小于0.95),共有峰保留时间RSD值小于2%,峰面积RSD值不大于96%,表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取浙江产瓜子金药材(S1),按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h检测其指纹图谱,以第1次进样图谱为对照,导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年A版),计算相似度。结果,7次测定相似度均不小于0.98,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取浙江产瓜子金药材(S1),按照“2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液6份,按“2.3.1”项下色谱条件进样,以第1份进样所得图谱为对照,导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年A版),计算相似度。结果,6份样品相似度均不小于0.99,符合指纹图谱相关要求(不小于0.95),表明本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱 将12批瓜子金药材按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按 “2.1”项下色谱条件进行测定,记录各批次瓜子金提取物的UPLC色谱图。导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年A版),设定样品S1色谱图为参照图谱,对保留时间的色谱峰进行多点校正,自动匹配,时间宽度为0.1 min,经系统自动匹配,生成对照图谱R,并建立各批次瓜子金提取物的指纹图谱,见图3。

  

图3 12批瓜子金提取物的指纹图谱及对照图谱(R)

 

Figure 3 Fingerprint chromatogram of total saponins from 12 batches of Polygala japonica Houtt.

2.5.2 相似度评价[10] 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年A版),计算12批瓜子金提取物UPLC图谱的相似度,以生成的对照图谱为参照,12批提取物对对照图谱的相似度分别为0.897、0.767、0.947、0.961、0.972、0.968、0.835、0.678、0.523、0.662、0.958、0.904。

由结果可知: S3、S4、S5、S6、S11、S12与对照图谱的相似度均在0.90以上,其产地均为河南; S1、S7与对照图谱的相似度为0.8左右,其产地均为浙江;S2与对照图谱相似度为0.7左右,其产地为广西;S8、S9、S10产地为四川,其相似度值较接近。以上数据表明,瓜子金皂苷提取物的相似度与产地有很大的关系。

2.5.3 部分共有峰初步结构分析 根据部分共有峰馏分光谱指数图(见图4)可知,共有峰1、3、6均为230、330 nm左右双峰吸收,可以归为一类,以下简称“A类”;共有峰5、10、11、12、13、14、19、20为230、310 nm左右双峰吸收,可以归为一类,以下简称“B类”;共有峰8、9、15为250、350 nm左右双峰吸收,可以归为一类,以下简称“C类”。

  

图4 主要共有峰馏分光谱指数图

 

Figure 4 Fraction spectral index diagram of main common peaks

工程项目管理信息化建设中,业主缺乏技术经验,仅凭开发商的宣传和自身经验作出投资判断,在投资和开发商选择上容易作出错误的判断。因贪图一些小利而导致成本增加,致使信息化建设以失败告终。为了避免这种结果发生,就要从根本上解决委托代理之间这种信息不对称的问题。在信息化建设中引入第三方会改善业主所处的劣势地位。第三方提供的专业的评估意见会帮助业主更为理性、客观的选择开发商合作,降低投资风险。业主与第三方、开发商之间构成了微妙的利益关系,三方对信息资源各取所需,从而使工程项目管理信息化建设成功的展开。

对比“A类”物质与“B类”光谱图(图5),二者分别在230、330 nm左右和230、310 nm左右均有双峰吸收,因此,推测二者结构相似,可能仅是发色基团稍有不同。

研究表明,黄酮类化合物在200~400 nm的区域内分别存在峰带I(300~400 nm)及峰带Ⅱ(220~280 nm)2个主要紫外吸收带,不同类型的黄酮化合物的带Ⅰ或带Ⅱ的峰位、峰形和吸收强度不同[13]。瓜子金皂苷“C类”物质光谱图(图4)显示其在250、350 nm双峰吸收且350 nm处的吸收强度低于250 nm。因此推测“C类”物质可能包含类似黄酮的2个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结的结构[11]

  

A.瓜子金皂苷己结构图; B.瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ结构图; C.瓜子金皂苷己光谱图; D.瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ光谱图

 

图5 瓜子金皂苷己、瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ对照品结构及光谱图

 

Figure 5 Structure and spectrograms of reference substances

2.6 瓜子金提取物的聚类分析[14]

按《中国药典》方法测定12批瓜子金药材中瓜子金皂苷己的质量分数(表5),并结合以上研究结果可见,主成分分析的总得分或许跟采收时间、瓜子金皂苷己质量分数、相似度均有关系。如S12和S10,均为2017年5月采摘,但前者瓜子金皂苷己质量分数较大且与生成的对照图谱相似度值较大,推测是其主成分分析排名第一的原因。S12与S5相比,存储时间短、瓜子金皂苷己质量分数较大,主成分分析排名靠前。总的来看,2017年春季采摘的各产地药材占据排名前5;S1、S2瓜子金皂苷己质量分数较高,但存储时间较长,可能导致其排名稍后。综上所述,采摘季节及存储时间可能对主成分分析排名有一定的影响。

  

图6 12批瓜子金提取物的聚类分析树状图Figure 6 Cluster analysis of 12 batches of extracts

2.7 瓜子金提取物共有峰的主成分分析[14]

用SPSS软件对瓜子金提取物共有峰的原始数据进行标准化处理,以主成分的特征值及贡献率为依据,对12批不同产地瓜子金药材提取物的21个共有峰进行主成分分析,结果见表2。可见,前5个因子A1、A2、A3、A4、A5的特征值大于1,对总方差的累积贡献率达87.8%,可以代表指纹图谱中的大部分信息。

 

2 主成分特征值及贡献率结果Table 2 Eigenvalue and contribution rate of PCA

  

主成分特征根值方差贡献率/%累积方差贡献率/%A16.57231.29631.296A26.02928.71160.007A32.55012.14372.149A42.13910.18782.336A51.1575.50787.844

由图2可知,210 nm通道与230 nm通道检测结果相似,但210 nm存在较大的末端吸收影响,图谱结果较差于230 nm通道。因此,最终选择230 nm通道建立瓜子金总皂苷指纹图谱。

“人并不仅仅是一个个体的概念,人的意义只有在社会关系或类的关系中才得到彰显”[9],人虽然以个体的形式存在于世界,却始终保持着类的特性,自我发展的生命历程离不开各种社会关系的建构,始终与“他者”保持最亲密的联系。正是因为类的存在,确立了个体在公共领域中交往的可能性,实现人在群体之中的双向对象化实践。无论是现实世界还是公共空间都是人本质力量对象化的产物,是人共同努力的成果,人拥有平等的权力共享发展的成果。每个人既有享受公共成果的权利,也有捍卫每个人平等身份的义务,公共空间才能在有限的场域中,呈现最大的价值。

各样品在各个成分上的得分以及总得分见表4,可见,S12得分最高,其次为S10、S5。

 

3 主成分载荷矩阵Table 3 Component matrix

  

共有峰编号主成分A1A2A3A4A510.179-0.2370.917-0.0860.1182-0.0660.5960.365-0.3830.1443-0.581-0.1430.7250.076-0.00940.8210.0420.242-0.335-0.23150.298-0.865-0.100-0.211-0.10960.6440.0190.378-0.455-0.01570.896-0.265-0.021-0.272-0.05580.1330.5470.174-0.2580.62990.169-0.7590.3470.4350.27610-0.3080.7440.3560.228-0.229110.540-0.774-0.1960.1910.060120.442-0.5320.2390.5930.28013-0.0880.5300.4980.444-0.34614-0.109-0.8810.0520.1390.045150.7560.4340.0070.1490.302160.774-0.1560.0220.163-0.401170.7960.532-0.231-0.0980.063180.3550.691-0.3360.4340.220190.9050.1620.169-0.118-0.083200.2150.607-0.0720.489-0.086210.8800.2050.1230.360-0.079

 

4 各主成分分析得分结果Table 4 PCA score

  

样品编号A1A2A3A4A5总得分排序S120.990.210.52-0.56-0.550.391S10-0.160.56-0.020.560.500.222S50.33-0.02-0.370.850.850.213S2-0.240.410.39-0.742.150.154S10.02-0.780.791.160.570.035S9-0.360.47-0.020.67-1.070.036S60.040.12-0.550.39-0.81-0.037S7-0.380.081.20-0.39-1.19-0.078S110.05-0.03-0.83-0.28-0.04-0.149S40.04-0.10-0.69-0.23-0.29-0.1610S30.11-0.370.07-0.70-0.05-0.1611S8-0.45-0.55-0.48-0.74-0.09-0.512

以不同产地瓜子金药材提取物的21个共有峰峰面积为原始数据,用SPSS软件对药材进行系统聚类分析,采用Ward′s 方式,以平方Euclidean距离公式进行聚类分析的结果见图6。可见,瓜子金皂苷提取物可分为3类:第1类, S4、S11、S6、S3、S5、S1、S8;第2类,S7、S9、S10、S2;第3类,S12。表明结果不单与产地相关,可能还受其他因素影响。

 

5 12批瓜子金提取物综合分析结果Table 5 Results of 12 batches of Polygala japonica Houtt.

  

编号采收地采收日期w瓜子金皂苷己/%相似度聚类分析主成分分析排序S12河南南阳2017-050.570.90431S10四川绵阳2017-050.440.66222S5河南信阳2017-020.530.97213S2广西桂林2017-040.950.76724S1浙江金华2017-020.650.89715S9四川遂宁2016-050.520.52326S6河南信阳2016-120.480.96817S7浙江金华2016-100.510.83528S11河南平顶山2016-080.500.95819S4河南南阳2016-050.490.961110S3河南洛阳2016-020.570.947111S8四川绵阳2016-100.370.678112

3 讨论

目前,瓜子金皂苷的测定多采用高效液相-蒸发光检测法[1,8],本文在试验中发现高效液相-蒸发光检测法与高效液相-蒸发光检测法两种方法在相同的色谱条件下分析皂苷提取物图谱信息等均很相似,由于高效液相-紫外检测法的稳定性、重现性以及色谱图信息量均较优,本文最终采取高效液相-紫外检测方法建立瓜子金总皂苷指纹图谱。检测波长选择230 nm,避免了210 nm末端吸收的影响。

从图2中还可见,本文建立指纹图谱方法确认了提取物中瓜子金皂苷己及瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ,且二者含量均不高,但通过“2.4.3”项下分析推测可知,质量分数较高的物质与瓜子金皂苷ⅩⅩⅪ具有相似的结构,初步获得结构信息,下一步将分离单体进行结构确认,因此本研究建立的指纹图谱并没有以两者为指标成分。另外,对比提取物与药材的图谱,可见提取物保留了质量分数较大的成分且提取出了一些极性较大的成分。

乔健在讲话中指出,养殖废弃物的合理利用已经成为制约目前畜产品供给和环境保护的重大环节,废弃物处理好坏对畜牧业可持续绿色发展具有重大的意义。同时随着养殖业的不断发展产生了大量的废弃物,如何有效地进行无害化处理与资源化利用是摆在当前的一大难题。养殖废弃物资源化利用已经形成了国家层面的战略,作为第二期省现代农业产业技术体系蛋肉鸡创新团队必须要回应这一重大需求,在养殖粪污处理之中做出应有的贡献。

本文建立了瓜子金皂苷提取物(以总皂苷为指标筛选优化提取分离纯化的工艺研究将另文发表)的指纹图谱,由于样品产地以及采摘时间的不同,各指纹谱图也有所差异,进一步采用聚类分析法进行分类,结果12批提取物分为3类,其结果与药材产地有一定的关系,再经主成分分析法得到5个共有特征成分,结果表明采收季节、存储时间影响较大。另外,从表5可见,瓜子金皂苷己质量分数跟采收时间具有一定关系,春季采收则质量分数略高。综上所述,建议采收春季瓜子金药材、并尽量缩短存储时间,且产地以河南及广西为宜。

本研究购买的12批次药材按照《中国药典》方法测定其中瓜子金皂苷己的质量分数,结果只有2个批次达到《中国药典》的要求(S1:0.65%;S2:0.95%),其对应主成分分析得分排序分别为5、4。因此,瓜子金皂苷己作为瓜子金药材的唯一评价指标是否合理,值得进一步考量。

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王若楠,张蜀,邓红,杜枚倩,赖昌威,列文耀,江戈,曾明莹
《广东药科大学学报》2018年第02期文献

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