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利用大肠杆菌高效制备人端粒酶逆转录酶抗原肽

更新时间:2009-03-28

端粒是位于真核细胞染色体末端的一段DNA-蛋白质复合体,其长度与染色体末端融合和退化密切相关,可反映细胞的复制潜能[1]。端粒酶是有效维持端粒长度的功能单位,其过度激活可导致细胞过度增殖,并导致恶性肿瘤发生[2-3]。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是人端粒酶的催化活性亚基,在端粒酶催化功能中扮演关键角色[4]。hTERT在85%以上的人类恶性肿瘤中过度表达,而在正常组织中表达极少[5]。当下调hTERT的表达时可导致端粒酶活性降低,端粒缩短,继而发生细胞凋亡[6]。因此,hTERT是肿瘤免疫治疗的理想靶位点。

多肽疫苗和DC疫苗是肿瘤免疫治疗的热点方向[7-9],采用多表位抗原肽来构建各类疫苗在策略上比单表位抗原肽更易于成功[10-12],因此,采用基因工程手段建立hTERT抗原肽高效制备方法具有重要意义。大肠杆菌基因工程系统是多肽抗原理想的廉价高效生产系统,但hTERT由于其结构的复杂性而很难在大肠杆菌系统进行高效表达。有人曾尝试将hTERT截断为3段分别在大肠杆菌中表达,但仅有一段容易表达[13];也有人成功表达出hTERT部分肽段[14-15],但最终未成功制备出hTERT抗原肽。还有人利用原核表达系统成功表达出hTERT的T基序区和C区,但表达后所得包涵体经纯化后并未对其进行复性研究[16]。本文通过采用生物信息学手段,将抗原表位预测及肽段亲疏水性分析相结合,成功筛选到hTERT的高效表达、并易于分离纯化的片段,为进一步研制肿瘤疫苗打下了较好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 E. coli BL21(DE3)与表达载体pET-21b购于Invitrogen公司;E. coli DH5α购于TaKaRa公司。

1.1.2 实验试剂 DNA聚合酶、Hind Ⅲ、Ned Ⅰ、T4 DNA连接酶、Protein Molecular Weight Marker(Low)等购于TaKaRa公司;质粒小提试剂盒及胶回收试剂盒均购自AXYGEN公司;其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 实验仪器 JW-3021HR高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司);LDZX-50KBS蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);D2010W电动搅拌机(上海司乐仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位分析 分别采用NIH的BIMAS软件(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)和德国海德堡生物医学信息中心的SYFPEITHI软件(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)对hTERT片段的氨基酸序列进行扫描,选择限制型表位为HLA-A2(HLA-A*0201),长度为9个氨基酸。采用EpiJen软件(http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm)对hTERT片段的氨基酸序列进行扫描,设置的参数为:HLA限制性取HLA-A2(HLA-A*0201),蛋白酶体临界值取0.1,TAP预测临界值取5.0,输出临界值取5%。首先量化矩阵处理蛋白酶体裂解的交叠肽,插入裂解位点和其相邻的氨基酸残基,再应用TAP结合量化矩阵对已有的实验结果进行处理,应用多个量化矩阵处理,筛选能与MHC分子结合的表位肽。根据以上得分结果,分析可能存在的hTERT限制性表位肽。

1.2.2 亲疏水性分析 采用ProtScale软件(http://web.expasy.org/protscale/)对hTERT片段的氨基酸序列进行预测。根据序列上的亲水性得分,再结合可能存在抗原表位的区域,选择亲水性高的片段截短表达。

1.2.3 目的基因合成 以http://www.jcat.de/Start.jsp在线软件设计大肠杆菌偏爱密码子基因,委托上海生工合成。

1.2.4 工程菌构建 目的基因两端分别引入Ned Ⅰ 和Hind Ⅲ酶切位点,按常规方法克隆于表达载体pET-21b的NdeI-Hind Ⅲ位点,转化E. coli BL21(DE3),经DNA测序确证得重组子。按常规方法以1 mmol/L IPTG进行表达诱导, SDS-PAGE法分析鉴定重组子目的基因表达。

1.2.5 包涵体蛋白纯化与复性 表达诱导所获菌体按1∶5(w/v)悬浮于含100 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH8.2)超声破碎液中,用超声波法破碎,10 000 r/min离心,弃上清,缓冲液重悬,超声破碎30 min后按上述方法离心后弃上清,所获沉淀用含2 mol/L 尿素的20 mmol/L Tris-HCl(pH8.2)溶液洗涤。所获包涵重悬至20倍体积(v/w)的包涵体裂解液(0.5 mol/L NaCl,8 mol/L尿素20 mmol/L Tris-HCl,pH8.2)中,室温下120 r/min搅拌过夜。溶解所获包涵体蛋白按常规方法采用镍柱纯化,后逐滴到含20 mmol/L Tris-HCl(pH8.2)复性液中进行稀释复性,边滴加边搅拌,调整蛋白终质量浓度约为0.1 mg/mL。

2 结果

2.1 hTERT截短表达分析

从GENBANK获取hTERT的氨基酸序列(序列号ALP75633),共有1 132个氨基酸。根据抗原表位预测结果(结果未呈)将hTERT截短为MG(Met1-Gly479)、SL(Ser480-Leu665)和AA(Asn666-Asp1132)等 3个片段,按大肠杆菌系统偏爱密码子合成的基因片段克隆于表达载体pET-21b和宿主细胞E.coli BL21(DE3)中进行表达,结果如图1所示。结果显示只有SL(Ser480-Leu665)片段可以高效表达。该表达产物为包涵体蛋白,但在含8 mol/L尿素(图2)和6 mol/L盐酸胍(结果未呈)等高浓度变性剂中均不能有效溶解。

  

M. Protein Molecular Weight Marker;1 .IPTG诱导组; 2.未诱导组。

 

图1 hTERT截断表达产物的SDS-PAGE分析

 

Figure 1 Truncate expression products of hTERT by SDS-PAGE

  

M. Protein Molecular Weight Marker; 1.SL段表达包涵体; 2、3、4、5、6、7、8分别是包涵体裂解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h和12 h后的离心上清

 

图2 SL(Ser480-Leu665)片段包涵体溶解SDS-PAGE分析

 

Figure 2 Dissolution of SL(Ser480-Leu665)inclusion bodies by SDS-PAGE

2.2 hTERT抗原肽可溶性优化

采用ProtScale对SL(Ser480-Leu665)段的亲水性和疏水性进行分析(图3,表1),结果显示Ile540-Thr565之间的肽段疏水性相对较高,可能是包涵体不能在高浓度变性剂中溶解的原因。根据BIMAS、SYFPEITHI和EpiJen等3种抗原表位预测软件分析,TI(Tyr562-Ile665)片段仍有较多的抗原表位(表1),因此,采用该肽段作为hTERT的候选抗原肽。

  

图3 hTERT(Ser480-Leu665)亲水性ProtScale分析

 

Figure 3 Hydropathicity analysis of hTERT(Ser480-Leu665)by ProtScale hTERT

 

1 hTERT(Ser480-Leu665)亲水性综合分析结果

 

Table 1 Results of hydropathicity analysis of hTERT(Ser480-Leu665)

  

PositionGrandaverageofhydropathicityPeptides480-540-0.822P3541-5651.260P1;P4;P7566-615-0.946P2;P8616-6450.065P6646-665-0.505P5

 

2 BIMAS、SYFPEITHI和EpiJen 软件预测hTERT(Ser480-Leu665)抗原表位Table 2 Epitopes of hTERT(Ser480-Leu665)predicted by BIMAS,SYFPEITHI and EpiJen

  

NumberStartpositionSubsequenceResidueBIMASSYFPEITHIEpiJeneP1540ILAKFLHWL1745.714309.929P2572RLFFYRKSV257.342228.474P3504SLQELTWKM152.766230P4548LMSVYVVEL60.325299.158P5563RLTSRVKAL49.134230P6616LLTSRLRFI44.871237.921P7555ELLRSFFYV1169.81409.38P8579SVWSKLQSI0228.242

2.3 hTERT(Tyr562-Ile665)表达与纯化

将hTERT(Tyr562-Ile665)目的基因克隆于pET-21b和E.coli BL21(DE3)后仍可高效表达,表达产物大小约为15 000,与理论大小相符,且与hTERT(Ser480-Leu665)一样,产物仍以包涵体蛋白形式存在(图4)。

  

M. Protein Molecular Weight Marker;1. IPTG未诱导组;2. IPTG诱导组; 3.超声前混悬液样品; 4.超声破碎后离心上清; 5.超声破碎后离心沉淀。

 

图4 SDS-PAGE分析hTERT(Tyr562-Ile665)表达产物形式

 

Figure 4 Expression product of hTERT(Tyr562-Ile665)by SDS-PAGE

与hTERT(Ser480-Leu665)不同的是,hTERT(Tyr562-Ile665)的包涵体蛋白可用含有8 mmol/L尿素的缓冲液有效溶解(图5A)。包涵体蛋白溶解后采用镍柱层析一步即可达到95%以上的纯度,并可通过常规的稀释复性法获得稳定的复性蛋白(图5B)。因此,hTERT(Tyr562-Ile665)可以作为候选抗原肽进一步研究。

BIM是通过管理真实世界中“物体”在数字世界中的“映射”,从而掌握真实世界的发展现状以及对后续的发展情况进行预判。一个是虚拟,一个是现实,这两点必须要关联起来BIM才能够真正发挥作用,这两点如果差别很大,BIM则就失去了实际的作用,成为了只具备三维表现功能的工具。

  

A. 包涵体蛋白的溶解(M. Protein Molecular Weight Marker;1. 包涵体洗涤离心上清; 2.包涵体裂解离心沉淀; 3.包涵体裂解离心上清)。 B.包涵体蛋白复性(M. Protein Molecular Weight Marker;1.纯化后的包涵体蛋白; 2.复性蛋白)。

 

图5 hTERT(Tyr562-Ile665)包涵体蛋白复性

 

Figure 5 Refolding of hTERT(Tyr562-Ile665)inclusion bodies

3 讨论

危险不但代表了危险可能出现,还蕴藏了后果的严重性,所以对于危险源需要进行风险评价,通过科学判断其危害等级及深浅度来预防和控制危害。企业实际生产中,需要根据实际情况采用定性或定量的评价方法来评价危险源的危害程度和大小。这两种评价方式各有千秋,实际评价中可以结合利用。

hTERT抗原肽在恶性肿瘤免疫治疗中具有广泛应用价值,但由于结构的复杂性很难采用廉价高效的大肠杆菌基因工程系统进行表达。作为抗原肽而言,并不需要全分子表达,所以截短表达是可行策略。为了确保截短表达产物具有足够的抗原性,采用SYFPEITHI、BIMAS[17]与EpiJen等3种不同原理的抗原表位分析软件进行相关预测,并初步确定了分3段表达的策略,按大肠杆菌偏爱密码子优化目的基因,并克隆至含有T7强启动子的pET-21b表达载体,但研究结果表明仅SL(Ser480-Leu665)片段可高效表达,表达产物为包涵体蛋白,且采用常规的高浓度尿素和盐酸胍类变性剂等均无法使其溶解,为制备能有效复性并可用的抗原肽提出了挑战。大量疏水性氨基酸的存在常常是导致蛋白质或多肽片段难溶的主要原因,采用ProtScale软件对SL(Ser480-Leu665)片段进行亲疏水性分析,结果显示Ile540-Thr565段序列疏水性较强,推测该段高疏水性序列的存在是包涵体蛋白不能溶解的关键原因,据此选择hTERT(Tyr562-Ile665)作为候选肽进行重新构建。结果表明去除这段高疏水性序列后的肽段不仅能够高效表达,并且能有效溶于高浓度变性剂溶液,也能够通过简单的稀释复性方法有效复性。

通过软件预测抗原表位是一种有效的抗原肽筛选方法。SYFPEITHI和BIMAS均是基于矩阵法,用统计学方法对多肽分子在肽结合槽内特定位点出现某个氨基酸的频率进行分析,用于建立频率矩阵对候选肽进行评估及预测。EpiJen通过逐步过滤的方法联合应用,模拟了体内抗原呈递的过程。由于不同软件的预测效率与结果可能不一样,通过整合不同预测程序的结果,可以提高预测的效率。在我国人群的人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ类抗原中,A2抗原频率高达53%,且一般情况下能够与MHC-I类分子特异性结合并且具有较高的亲和力的多肽通常为含有9个氨基酸的九肽[18-19]。所以本实验在进行相关表位分析时将表位限制型设为HLA-A2,肽的大小为九肽。尽管采用不同软件对候选的hTERT SL(Ser480-Leu665)进行了比对分析,但能否作为治疗用途DC疫苗或多肽疫苗尚需进一步的实验评价。本研究筛选到了可在大肠杆菌系统高效表达、并容易复性的hTERT抗原肽,为相关肿瘤疫苗的研究打下了良好的基础。

艾氏卡法主要用于测定煤和生物质中的Cl及S的含量[16-17]。该方法的基本原理是将干燥的煤样和艾士卡试剂(MgO∶Na2CO3 = 2∶1)均匀混合,在680℃下共同燃烧,利用艾士卡试剂将氯化物或硫化物充分吸收。

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张雅雯,张鸿,赵林,郭土敬,李泽民,祝贺,刘国强,李黄金
《广东药科大学学报》2018年第02期文献

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