0引言

视网膜母细胞瘤常见于婴幼儿，严重危害患儿的视力和生命，5岁以下儿童发病率较高。视网膜母细胞瘤常见的治疗方法有手术治疗、外部放疗等，这些治疗手段虽然大大提高了患儿的生存率，但是治疗失败的病例仍然很多，其中国际视网膜母细胞瘤分类D类治疗失败率约高达77% [1-2]。探讨视网膜母细胞瘤的发病机制，寻找有效的抗肿瘤辅助方法，提高视网膜母细胞瘤患者的生存率是目前研究的重点。肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF6)是肿瘤坏死因子受体家族中的成员，因其能够与肿瘤坏死因子结合而得名，其通过调控成骨细胞分化、神经系统发育等生理过程，参与糖尿病、肿瘤等疾病的发生发展过程[3-4]。有研究表明，TRAF6在卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等癌症组织中的蛋白表达水平高于正常组织，并与肿瘤的发生发展和预后息息相关[5-8]。本研究运用MTT法、细胞克隆、流式细胞术、Transwell小室等多种实验方法，探讨沉默TRAF6对人视网膜母细胞瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响，以期为临床治疗视网膜母细胞瘤提供新的治疗靶点。

1材料和方法

1.1材料 视网膜母细胞瘤Y79细胞购自中国科学院细胞库；TRAF6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂为美国Invitrogen公司产品；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素为美国Gibco公司产品；qRT-PCR试剂盒为美国GeneCopoeia公司产品；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品；TRAF6单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物标记的二抗均为美国Cell Signaling公司产品；TRAF6小干扰RNA(TRAF6 siRNA)和阴性对照序列(siRNA control)为上海义森生物科技有限公司产品。

通过进行产前超声检查能够发现胎儿的肺内部异常病灶，特别是运用彩色多普勒超声检查能够对胎儿的肺囊腺瘤以及隔离肺两类比较多见的肺内异常病灶进行明确提示和诊断。由于隔离肺和肺囊腺瘤均具有比较显著的超声特点，因此通过进行产前超声检查有利于发现胎儿的肺内异常，并结合隔离肺和肺囊腺瘤的超声特点进行具体判断予以明确[2]。

1.2方法

单位在用该方法来展开分析时，其需要把成本看成是产量的函数，然后再从此角度来展开研究，当得出结论之后，其需要与原始的成本与当前的结果进行成本区分，即主要分为两大类型。需要注意的是，联系成本与产品自身的动态分析，其是构成管理会计的重要部分。

1.2.1细胞培养 将Y79细胞自液氮中取出，迅速放到37℃的水浴锅中，使细胞在1min内融化后，加入10倍体积的细胞培养液(含有100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10%胎牛血清，80%RPMI 1640培养基)，800r/min离心10min，以2×105个/mL种植于细胞培养瓶，在37℃、5% CO2培养箱中培养2d，细胞密度超过80%时，转移细胞悬液至离心管中，1000r/min离心10min，弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤细胞两次，加入5mL细胞培养液，接种到细胞培养瓶中培养。

1.2.3qRT-PCR检测TRAF6的表达 取干扰组、NC组、对照组对数生长期的Y79细胞，培养24h，收集细胞，加入1mL Trizol裂解后(每10cm2细胞加入1mL Trizol)，室温静置5min，转移细胞裂解液至EP管中，加氯仿200μL，震荡混合15s，室温静置3min，12000r/min，4℃离心15min，吸取上清，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min，12000r/min，4℃离心15min，弃上清液，加入500μL 75%乙醇溶液，10000r/min，4℃离心15min，弃上清液，将RNA保存于-80℃。用紫外分光光度计检测提取的RNA浓度及纯度。qRT-PCR检测细胞中TRAF6水平。TRAF6上游引物：5’-GAATCACTTGGCACGACATT-3’；下游引物：5’-GAGTTTCCATTTTGGCAGTCA-3’。GAPDH上游引物：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’；下游引物：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。反应程序为：94℃，5min(1个循环)，94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，共35个循环，72℃，5min。内参基因为GAPDH，采用2-△△Ct法计算TRAF6 mRNA水平。

“哎，范青青，你不是说要去旅行。你选地方，给你两天时间。”打完电话他就又后悔了，这不就是犯贱吗？但来不及了，范青青连一秒都没有耽搁，回他：“OK！不许反悔，反悔是小狗。”

1.2.2细胞转染 取对数生长期的Y79细胞，离心后，收集细胞，接种于6孔板中，实验分组为对照组、NC组(siRNA control)、干扰组(TRAF6 siRNA)。转染序列如下：(1)TRAF6A： Sense 5’-GCCUAAUCAUUAUGAUCUATT-3’，Anti-sense 5’-UAGAUCAUAAUGAUUAGGCAT-3’；(2)siRNA control：Sense 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。用Lipofectamine 2000将TRAF6 siRNA和siRNA control转染至细胞中，并分别标记为干扰组和NC组，同时设置未处理的细胞作为对照组。

2.2各组细胞增殖情况 对照组、NC组和干扰组细胞存活率分别为(100.18±4.87)%、(99.58±6.33)%、(63.53±4.14)%，差异有统计学意义(F=76.659，P<0.001；图2A)；对照组与NC组比较，细胞存活率差异无统计学差异(P=0.859)；干扰组与对照组、NC组比较，细胞存活率均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、NC组和干扰组细胞克隆形成率分别为(56.78±5.63)%、(54.18±6.91)%、(37.40±2.95)%，差异有统计学意义(F=18.816，P<0.001；图2B)；对照组与NC组比较，克隆形成率差异无统计学差异意义(P=0.463)；干扰组与对照组、NC组比较，克隆形成率均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，沉默TRAF6能显著抑制Y79细胞的增殖。

1.2.5MTT法检测细胞活力 取干扰组、NC组、对照组细胞，以2000个/孔接种到96孔板中，以加入细胞培养液、无细胞的组为空白组，每组设置5个复孔。24h后每孔中加20μL MTT溶液(5mg/mL)，孵育4h，加入二甲基亚砜溶液150μL，震荡混合10min，观察结晶物完全溶解，酶标仪检测490nm处每孔的光密度值(A)值。细胞存活率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.2.6克隆形成实验检测克隆形成能力 取干扰组、NC组、对照组细胞培养24h后，按照500个/孔接种细胞至6孔板，培养14d，甲醇固定15min，吉姆萨染色10min，自然风干后拍照(×200)并计数分析。克隆形成率=克隆数目/接种细胞数×100%。

摩擦惯性式压电驱动器工作原理如图3所示[4]，摩擦惯性式压电驱动器一般由摩擦块(结构本体)、压电块和惯性块组成，运动时，压电块先缓慢收缩，然后快速伸长实现位移，摩擦块与接触面之间存在摩擦力，使摩擦块能够保持位置。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期 (1)干扰组、NC组、对照组细胞培养24h后，取1×106个细胞与500μL的结合缓冲液混合后，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)各5μL，避光环境下反应20min，加结合缓冲液100μL，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(2)干扰组和NC组、对照组细胞培养24h后，收集细胞，加入预冷的70%乙醇溶液，4℃静置24h，PBS洗涤细胞2次，2000r/min离心5min，吸除上清液，加入1mL PI，混合后室温静置15min，流式细胞仪检测细胞周期，分析周期分布情况。

1.2.8Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力 (1)取对数生长期干扰组、NC组、对照组细胞，调整细胞密度为5×106个/mL，在Transwell小室的下室加入600μL细胞培养液，上室加入细胞悬液100μL。在37℃，5% CO2培养箱中培养24h后，取出Transwell小室，将多余的细胞擦掉。收集下室的细胞，在显微镜下(×200)计数，计算细胞迁移数。(2)Matrigel基质胶以50μL/孔加入到24孔的Transwell小室中，4℃过夜晾干。侵袭实验前60min，在小室内加不含血清的培养液孵育30min。调整细胞密度为1×105个/mL，每孔加200μL细胞悬液至小室的上室，500μL细胞培养液加入下室，培养24h。吸除多余的培养液，棉签擦除未穿膜的细胞，甲醇固定30min，染色2h，PBS洗涤3次，去除基质膜，放置于盖玻片上，甘油固定，显微镜下(×200)观察侵袭细胞数量。

 

图1 各组细胞中TRAF6 mRNA及蛋白表达水平A：TRAF6 mRNA相对表达水平；B：Western blot检测蛋白表达；C：TRAF6蛋白相对表达水平。aP<0.05 vs 对照组。

 

图2 TRAF6对细胞增殖能力影响A：各组细胞存活率；B：各组细胞克隆形成率。aP<0.05 vs 对照组。

小麦药剂拌种方法主要有调节剂(多效唑、矮壮素等)、杀虫(菌)剂(粉锈宁、绿享2号等)、微肥、微生物菌剂拌种。调节剂拌种能促根增蘖，加强麦苗抗逆性，降低株高等。杀虫(菌)剂拌种可预防白粉病、纹枯病、蝼蛄、蛴螬、金针虫等病虫危害。微肥拌种可以提高植株抗病能力，利于高产。微生物菌剂拌种具有促进根系发育和分蘖作用。注意选择对小麦生长不产生副作用的药剂类型。

统计学分析：用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用one-way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1各组细胞中TRAF6表达情况 各组细胞中TRAF6 mRNA和蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(F=29.272、85.775，P<0.001)。qRT-PCR检测结果显示，对照组、NC组和干扰组TRAF6 mRNA相对表达量分别为1.02±0.03、0.99±0.05和0.62±0.06(图1A)，对照组与NC组比较差异无统计学意义(P=0.648)，干扰组TRAF6 mRNA表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示，对照组、NC组和干扰组TRAF6蛋白相对表达量分别为0.707±0.048、0.723±0.027、0.254±0.044(图1B、C)，对照组与NC组比较差异无统计学意义(P=0.696)，干扰组TRAF6蛋白表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，TRAF6 siRNA能够有效抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞中TRAF6的表达。

1.2.4Westernblot法检测TRAF6表达 取干扰组、NC组、对照组对数生长期的Y79细胞，培养24h，收集细胞，加入裂解液，4℃孵育30min。吸取细胞裂解液，12000r/min，4℃离心10min。吸取蛋白上清，BCA蛋白浓度检测试剂盒检测提取的蛋白浓度。将提取的蛋白与5×Loading buffer充分混合(4∶1)，100℃煮沸5min使蛋白变性，按照每个上样孔加入50μL变性蛋白样品110V恒压电泳2h。4℃，100V转膜1h。5%脱脂奶粉37℃封闭1h。一抗(1∶1000)4℃孵育过夜。二抗(1∶2000)37℃孵育1h。显色、曝光，采用Image图像分析软件分析蛋白表达水平。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

表1 各组细胞周期检测情况

  

组别G0/G1SG2/M对照组5668±8353658±291674±232NC组5965±9473546±467489±325干扰组8018±6281625±281354±135F791426522131590P<0001<0001<0001

注：对照组：未处理的Y79细胞；NC组：转染siRNA control的Y79细胞；干扰组：转染TRAF6 siRNA的Y79细胞。

2.3各组细胞凋亡发生情况 对照组、NC组和干扰组细胞凋亡率分别为(9.89±0.33)%、(10.80±0.15)%、(32.05±3.11)%，差异有统计学意义(F=96.107，P<0.001)；NC组与对照组比较，细胞凋亡率差异无统计学意义(P=0.631)；干扰组与对照组比较，细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。结果表明，干扰TRAF6能够促进视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡。

2.4各组细胞周期检测情况 各组细胞G0/G1、S、G2/M期分布情况比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；对照组与NC组比较，各周期细胞所占比例差异均无统计学意义(P=0.753、0.882、0.329)；TRAF6 siRNA干扰Y79细胞后，G0/G1期的细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，与对照组、NC组比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)，提示干扰TRAF6能够阻滞视网膜母细胞瘤Y79细胞周期，将细胞周期阻滞在G0/G1期。

 

图3 TRAF6对细胞凋亡的影响A：流式细胞仪检测结果；B：各组细胞凋亡率。aP<0.05 vs 对照组。

 

图4 TRAF6对细胞迁移和侵袭能力的影响A：各组迁移细胞数目；B：各组侵袭细胞数目。aP<0.05 vs 对照组。

2.5各组细胞迁移和侵袭能力 对照组、NC组和干扰组Transwell小室中穿过聚碳酸酯膜迁移到膜背面的细胞数分别为95.8±4.4、95.0±6.3、58.6±7.4个，差异有统计学意义(F=57.010，P<0.001)；对照组与NC组比较，迁移细胞数差异无统计学意义(P=0.860)；与对照组和NC组比较，干扰组迁移细胞数显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、NC组和干扰组穿透Matrigel胶侵袭至膜背面的细胞数分别为99.8±4.9、97.2±8.7、73.0±8.6个，差异有统计学意义(F=18.552，P<0.001)；对照组与NC组比较，侵袭细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组和NC组比较，干扰组侵袭细胞数显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。以上结果表明，干扰TRAF6能够显著抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的迁移和侵袭能力。

3讨论

TRAF6基因定位于11p13，其编码的蛋白质含有511个氨基酸，分子量约60kDa，因其含有特殊的结构能够参与细胞内多种信号通路的转导，在细胞免疫等过程中发挥重要作用[9-11]。研究表明，TRAF6调控细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程[12-13]。Zhang等[14]通过免疫组化、RT-PCR法检测结直肠癌组织和正常组织中TRAF6的表达水平，结果发现，在结直肠癌组织中TRAF6 mRNA和蛋白表达水平均高于正常的癌旁组织，干扰TRAF6表达的结直肠癌细胞侵袭和迁移能力均下降。石琳等[15]在102例卵巢癌组织中发现TRAF6的阳性表达率高达68%，而在正常的卵巢组织中阳性率仅为20%，并且与卵巢癌的病理分期等有关。He等[16]通过细胞转染TRAF6干扰表达载体发现，宫颈癌细胞Hela、SiHa、CaSki细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显降低，细胞凋亡比例均升高。吴娟等[17]发现TRAF6蛋白的表达与乳腺癌细胞的侵袭能力有关。张刘平等[18]研究表明，TRAF6参与肿瘤恶病质骨骼肌炎症的发生。这些研究结果均表明，TRAF6与肿瘤的发生发展及转移有关。

1.2.1 引物设计与限制性内切酶选择 引物设计见表1。根据NCBI中gene数据库提供的人LncRNA-GHET1(NR－130107.1)的序列，应用 oligo6软件查找基因中存在的酶切位点，结合pcDNA3.1(－)上的酶切位点，选择限制性内切酶XHoⅠ与BamHⅠ。

正常情况下，细胞的增殖和凋亡处于动态平衡状态，当细胞发生癌变时，细胞异常增殖，凋亡减少。细胞凋亡的发生受到多种基因的严格调控，是一个极为复杂的过程，提高肿瘤细胞凋亡率，减少细胞增殖是多种抗肿瘤药物及抗癌基因作用的典型特征[19]。本研究通过细胞转染TRAF6 siRNA，采用qRT-PCR和Western blot法检测干扰效果，结果显示，转染TRAF6 siRNA后的视网膜母细胞瘤Y79细胞中TRAF6 mRNA和蛋白表达水平均显著下降，提示成功构建了干扰TRAF6表达的视网膜母细胞瘤Y79细胞系。通过MTT比色法、细胞克隆实验、流式细胞术检测发现，干扰TRAF6后Y79细胞的增殖受到抑制，凋亡率增加，细胞G0/G1期比例增多，表明干扰TRAF6能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期。

细胞迁移和侵袭是肿瘤转移的重要生物学特性。肿瘤细胞侵袭至周围组织中是肿瘤转移的第一步，肿瘤细胞通过微血管和淋巴管进入微循环，进而进入到邻近组织中发生肿瘤的转移[20]。本研究通过Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力，结果发现干扰TRAF6能够减少Y79细胞迁移和侵袭数目，提示干扰TRAF6能够抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，干扰TRAF6能抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡。本研究结果仅在体外探讨了TRAF6的作用，后续会在体内进一步研究TRAF6的作用及机制。本研究为后续探讨 TRAF6的作用机制奠定了基础，为视网膜母细胞瘤的治疗提供了新思路。

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14 Zhang T，Wang H，Han L. Expression and Clinical Significance of Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factor 6 in Patients With Colon Cancer. IranRedCrescentMedJ 2016；18(1)：e23931

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