雌激素对人类生殖系统的分化、成熟和功能发挥着重要的作用，对促性腺激素具有负反馈作用，其中雌激素受体（estrogen receptor，ESR）起着关键的调节作用[1]。ERα通过结合雌激素参与调节转录过程，包括核转录、结合特殊的效应原件和目的基因的表达进行调控；核ER是调节雌激素复合物功能的转录因子，即使没有直接结合到靶基因的DNA上，也可以通过与其他蛋白质相互作用，从而调控基因表达[2]。近年研究发现，ERα存在于人类生殖系统，其基因多态性与人类生殖行为之间表现出复杂的相互作用[3]。多项研究探讨ER基因多态性与男性不育的相关性，结果因研究对象遗传背景差异而不同。目前ERα PvuⅡ、XbaⅠ基因位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）与壮族男性生育力的相关性研究比较少。本研究在小样本壮族男性不育患者中尝试分析ERα PvuⅡ、XbaⅠ位点多态性与男性不育之间的相关性。

八条禁令的内容包括：严禁瞒报、谎报、迟报、漏报、阻碍他人报告动物疫情；严禁接到动物疫情举报不受理、不核查；严禁动物疫情排查不到场、不到位；严禁不履行动物疫病检测职责、出具虚假检测报告；严禁不检疫就出证、违规出证；严禁违规使用、倒卖动物卫生证章标志；严禁违规处置染疫或者疑似染疫的动物、动物产品及相关物品；严禁发现违法违规行为不查处。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年10月—2017年3月于右江民族医学院附属医院（我院）生殖医学中心就诊的壮族男性不育患者96例（观察组），排除女方因素，未避孕1年以上未育。已知临床因素（如精索静脉曲张、输精管梗阻等）和遗传因素（如染色体异常、Y染色体微缺失等）导致不育的患者除外，参考《世界卫生组织（WHO）人类精液检查与处理实验室手册》第5版诊断标准进行精液常规检查。作为一项临床初步分析，因为样本量较小，本研究未能根据精子密度进一步分组（如精子密度正常、少精、严重少精和无精），也未根据精子形态与功能进一步分组（如畸形精子症、弱精子症），但研究结果为今后的细致研究积累了资料和经验。76例（对照组）男性在未采取辅助生殖技术情况下至少育有1个孩子。本研究经我院伦理委员会批准，所有实验样本经知情同意后由研究对象自愿捐赠。

设A={C1,C2,C3,C4},由定义3计算每一个覆盖Ci({1,2,3,4})的诱导覆盖Cov(Ci)并根据定义4计算Cov(A)的元素如下

1.2 研究方法

2.2 ERα XbaⅠ和PvuⅡ基因型频率分布 XbaⅠ等位基因位点C、T在观察组的分布频率与对照组的分布频率差异具有统计学意义（P=0.002）。经检测该位点的3种基因型CC、CT、TT在观察组的分布频率与对照组的分布频率差异具有统计学意义（P=0.005）。PvuⅡ位点等位基因频率和基因型在2组间的分布差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表4。

2.3.1 rs2234693C/T 经检测等位基因和基因型频率分布在2组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步采用Logistic回归校正年龄等混杂因素，分析共显性、显性和隐性模型下ERα rs2234693位点的基因型与男性不育遗传易感性的相关性。结果显示在共显性（CC vs.CT）和显性遗传模型下并未发现存在统计学关联，在共显性（CC vs.TT）和隐性遗传模型下发现存在统计学关联（P隐性TT vs.CT+CC=0.002，OR=0.343，95%CI：0.176～0.670；P共显性TT vs.CC=0.006，OR=0.291，95%CI：0.120～0.704），C等位基因携带者患不育的患病风险比T等位基因携带者高。见表5。

1.2.3 ERα PvuⅡ、XbaⅠ基因SNPs检测分析 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物的设计由宝生物工程（大连）有限公司合成，PCR扩增反应体系、反应条件以及限制性片断长度多态性（RFLP）反应体系及反应条件，见表1。建立20 μL PCR体系，包括1 μL模板DNA，10 μL高保真2×Gold Star Taq Master Mix（大连TaKaRa），正、反向引物各1 μL，双蒸水7 μL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃ 10 min，见表2。将扩增得到的PCR产物用于酶切（NEB北京），酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。为确保基因分型结果的可靠性，采用单纯随机法对样本进行测序验证，测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，见图2、图3。1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。定量资料符合正态分布的数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本均数的t检验；不符合正态分布的数据则用中位数（四分位数）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。采用卡方检验或Fisher确切概率法分析2组等位基因和基因型频率分布情况；通过Logistic回归分析以年龄作为校正因素纳入遗传模式模型，对每个基因的SNP位点与男性不育发生的相关性进行风险评估，用比值比（OR）及95%可信区间（CI）表示风险强度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 ERα基因多态性位点与壮族男性生育力的相关性分析

翻译工作坊活动是《翻译理论与实践》课程形成性评价的重要组成部分。笔者采取“教师评分+学生互评”的评分机制，其中教师评分占50%，小组间的互评占50%，主要从译文质量、团队合作、课堂展示三个方面来评分，满分10分，其中译文质量占5分、团队合作2分、课堂展示3分，旨在从不同角度评判翻译工作坊开展的过程与效果，达到了公开、公平、公正的评分原则。

 

表1 PCR引物序列、SNP位点及限制性内切酶

  

SNP位点 内切酶 PCR产物大小 引物序列（5′→3′）rs9340799A/G PvuⅡ 347 bp 上游：ATCTGAGTTCCAAATGTCCC下游：ATCCACTTTATCCTGACATTTT rs2234693C/T XbaⅠ 350 bp 上游：GGCTCAAACTACAGGGCT下游：TTTCAGAACCATTAGAGACCA

 

表2 限制性内切酶反应体系及酶切产物大小

  

反应体系 PvuⅡ XbaⅠTotal（μL）2020 PCR产物（μL） 1 1 10×Buffer（μL） 2 2内切酶（μL） 0.7 0.7 ddH2O（μL） 16.3 16.3反应条件 37℃，60 min；65℃失活，20 min 37℃，60 min酶切产物大小（bp） 347/278/69 350/265/85

  

图1 目的片段限制性酶切产物电泳结果

 

注：a为XbaⅠ（CC：350 bp、CT：350/265/85 bp、TT：265/85 bp）；M：Marker；CC纯合型：4；TT野生型：5、6；CT杂合型：1、2、3。b为PvuⅡ（AA：347 bp、AG：347/278/69 bp、GG：278/69 bp）；M：Marker；AA纯合型：5；GG野生型：6；AG杂合型：1、2、3、4。

  

图2 ERα XbaⅠ测序图

 

注：ABC分别为CC基因分型、CT基因分型和TT基因分型。

  

图3 ERα PvuⅡ测序图

 

注：ABC分别为AA基因分型、AG基因分型和GG基因分型。

2 结果

2.1 临床样本基本资料以及群体代表性检验 对照组经Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，结果表明XbaⅠ （χ2=1.036，P=0.309） 和PvuⅡ （χ2=1.688，P=0.194）分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，提示对照组样本具有群体代表性。2组年龄、精液pH值、禁欲时间和精液量差异无统计学意义（P＞0.05），而前向运动精子百分比、正常精子形态百分比、精子浓度和精子存活率差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

1.2.1 精液分析 所有检测对象标本采集时使用手淫取精法，取精前禁欲2～7 d，收集于带刻度的、清洁干燥试管内，所有标本均于我院取精室内采取，确保送检时间的可控性和及时性。接收后立即放入37℃恒温箱内，并记录标本采集时间。精液常规检测采用西班牙SCA全自动精液分析系统，光学显微镜为OLYMPUS（日本，CX41-32C02），完成常规检测后标本进行Diff-Quik快速染色（参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第5版诊断标准）[4]。

依据淋巴结有无转移进行亚组分析发现，PCa盆腔淋巴结转移与PSA水平、Gleason评分、PI-RADS评分、临床分期、胞膜、精囊侵犯和PLAGL2 表达水平有关联(表2)。表3示，PLAGL2表达水平和Gleason评分是PCa淋巴结转移的独立危险因素。

1.2.2 基因组DNA提取 采用离心柱法提取基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪（岛津2000）测定DNA的纯度，以OD260/OD280比值而论定，纯度与浓度均合格的样本纳入研究，进行进一步的检测实验。

2.3.2 rs9340799A/G 经检测等位基因和基因型频率分布在2组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步采用Logistic回归校正年龄等混杂因素，分析在共显性、显性和隐性模型下ERα rs9340799A/G位点的基因型与男性不育遗传易感性的相关性。结果显示，在3种遗传模型下，ERα rs9340799A/G位点的基因型与男性不育的关联均无明显的统计学意义（P＞0.05）。见表5。

3 讨论

目前关于ERα基因多态性与男性不育的研究并不少，SNP位点可能对男性不育的发生、发展起到重要的调控作用，但很多结果报道并不一致[5-6]。在一些Meta分析中，由于男性不育具有高度的遗传异质性，不同地域及种族的人群可能有不同的遗传易感基因和SNP位点[7-8]。关于壮族男性生育情况的研究涉及到的有GSTT1和GSTM1基因多态性、ERβ基因RsaⅠ多态性、CYP1A2基因多态性分析等方面的研究[9-11]。本研究结果显示：经检测rs2234693C/T位点等位基因频率分布在2组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。进行遗传模型分析，Logistic回归校正年龄后发现ERα基因rs2234693C/T在共显性（CC vs.TT）和隐性遗传模型下存在统计学关联（P＜0.05），T等位基因携带者可降低男性不育的发病风险。本研究结果与巴基斯坦人群和伊朗人群的研究结果比较一致，皆认为XbaⅠ与男性不育的发病率之间具有一定的关系[5，12]。Bianco等[6]在巴西人群的研究中发现ERα（PvuⅡ、XbaⅠ）与特发性男性不育之间不存在相关性。在对伊朗人群的研究中PvuⅡ杂合型CT对男性不育的发病具有保护作用，且携带TT基因型的患者具有高浓度的血浆游离雌二醇（E2），相对较低的精子密度、活动力和更为异常的精子形态[12]。但未发现ERα基因位点PvuⅡ与男性不育发病风险存在相关性。SNP低显性遗传效应通常取决于与其他多态性位点的相互作用及包括饮食、生活方式等在内的特定环境因素的综合影响，因此遗传变异的影响可能为其他尚未发现的致病因素所掩盖[13]。

 

表3 2组样本资料比较

  

注：本次研究纳入研究对象观察组（96例），对照组（76例），由于部分临床数据脱落，共获得符合标准、资料完整的男性不育患者87例（观察组）和70例（对照组），纳入研究对象中无精子症患者11例（12.6%）。年龄、pH值、禁欲时间和精液量用x±s表示。精子浓度、精子存活率、前向运动精子百分比和正常精子形态百分比用M（P25，P75）表示。

 

（岁） 精液pH值 禁欲时间（d）观察组 87 31.05±5.84 7.14±0.42 4.45±1.78对照组 70 32.47±6.37 7.13±0.34 4.76±2.24 t或Z -1.459 0.156 -0.962 P 0.146 0.877 0.338正常精子形态百分比（%）29．90（12．25，62．60） 51．25（36．93，72．83） 24．80（15．30，47．05） 2．00（1．00，3．00）69．75（41．93，99．33） 80．55（72．73，90．13） 51．00（42．56，60．73） 5．00（4．00，6．00）-5.690 -7.327 -6.422 -9.726＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01组别 n 年龄 精液量（mL）3.08±1.55 3.18±1.14-0.455 0.650精子浓度（×106/mL）精子存活率（%）前向运动精子百分比（%）

 

表4 ERα基因PvuⅡ、XbaⅠ位点基因频率分布情况 [例（%）]

  

组别观察组对照组χ2 P n 96 76 rs2234693C/T rs9340799A/G基因型 等位基因 基因型 等位基因CC CT TT C T AA AG GG A G 25（26.0） 51（53.1） 20（20.9） 101（52.6） 91（47.4） 54（56.2） 38（39.6） 4（4.2） 146（76.0） 46（24.0）12（15.8） 31（40.8） 33（43.4） 55（36.2） 97（63.8） 50（65.8） 21（27.6） 5（6.6） 121（79.6） 31（20.4）10.45 9.229 2.877 0.620 0.005 0.002 0.237 0.431

 

表5 ERα基因2个位点的多态性与男性不育发病风险的Logistic回归分析

  

注：采用条件Logistic回归校正年龄等混杂因素。

 

遗传模型 基因型 观察组[n（%）] 对照组[n（%）] P OR（95%CI）rs2234693C/T共显性 CC 25（26.0） 12（15.8）CT 51（53.1） 31（40.8） 0.573 0.790（0.348～1.794）TT 20（20.9） 33（43.4） 0.006 0.291（0.120～0.704）显性 CC 25（26.0） 12（15.8）CT+TT 71（74.0） 64（84.2） 0.107 0.533（0.247～1.146）隐性 CC+CT 76（79.2） 43（56.6）TT 20（20.8） 33（43.4） 0.002 0.343（0.176～0.670）rs9340799A/G共显性 AA 54（56.2） 50（65.8）AG 38（39.6） 21（27.6） 0.124 1.675（0.868～3.233）GG 4（ 4.2） 5（ 6.6） 0.668 0.741（0.188～2.915）显性 AA 54（56.2） 50（65.8）GG+AG 42（43.8） 26（34.2） 0.205 1.496（0.803～2.787）隐性 AA+AG 92（95.8） 71（93.4）GG 4（ 4.2） 5（ 6.6） 0.484 0.617（0.160～2.383）

Dumasia等[14]指出，ERα激动剂治疗影响睾丸中染色质状态和相关的组蛋白修饰水平，突出了ERα在调节精子发生过程中的重要作用。有研究表明，ERαKO小鼠附睾输出小管重吸收功能受损，导致睾丸肿胀，抑制精子发生，改变附睾的渗透压环境，引起精子的尾部及其他的缺陷，影响精子的动力，这可能与mERα参与调节蛋白激酶B（AKT）信号通路有关[15]。Zalata等[16]研究发现，基因型pp（ERα PvuⅡ）、xx（ERα XbaⅠ）者在精子总数、精子动力和正常形态率明显高于基因型PP（ERα PvuⅡ）、XX（ERα XbaⅠ）者，等位基因P和X增加男性不育的风险，进一步阐明了ERα在男性不育的病因学中扮演着重要作用。除此之外，长期暴露于有毒的环境及污染物可影响基因的表观遗传修饰，导致基因选择性表达[6]，从而可能引起不同人群基因的多态性分布差异较大，而且其与疾病的相关性结论也不尽相同。

研究显示ERα基因XbaⅠ位点的变异可能与男性不育存在关联，但研究结果仍需通过大规模研究和男性不育等生殖功能的分析进行证实。但就目前所知，ERα蛋白参与了许多基因转录调控，基因突变和多态性影响基因表达进而影响生物功能，多态基因对蛋白分子具有调控作用，设计以ERα为靶点的靶向治疗，为男性不育的治疗开辟了新途径。

参考文献

[1] Dumasia K，Kumar A，Kadam L，et al.Effect of estrogen receptorsubtype-specific ligands on fertility in adult male rats[J].J Endocrinol，2015，225（3）：169-180.

[2] 吴艳，卞慧敏.雌激素受体信号转导途径和功能[J].安徽医药，2012，16（2）：242-244.

[3] Corbo RM，Ulizzi L，Piombo L，et al.Estrogen receptor alpha polymorphisms and fertility in populations with different reproductive patterns[J].Mol Hum Reprod，2007，13（8）：537-540.

[4] WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen,5th ed[S].Geneva:World Health Organization,2010.

[5] Liaqat S，Hasnain S，Muzammil S，et al.Polymorphism analysis in estrogen receptors alpha and beta genes and their association with infertile population in Pakistan[J].EXCLI J，2015，14：1085-1094.

[6] Bianco B，Peluso C，Gava MM，et al.Polymorphisms of estrogen receptors alpha and beta in idiopathic,infertile Brazilian men:a case-control study[J].Mol Reprod Dev，2011，78（9）：665-672.

[7] Ge YZ，Xu LW，Jia RP，et al.Association of polymorphisms in estrogen receptors（ESR1 and ESR2）with male infertility:a metaanalysis and systematic review[J].J Assist Reprod Genet，2014，31（5）：601-611.

[8] Li TF，Wu QY，Zhang C，et al.Polymorphisms in estrogen receptors predict the risk of male infertility:a meta-analysis[J].Reprod Biol Endocrinol，2014，12：79.

[9] 陈文成，康熙雄，韦叶生，等.壮族人群少精不育患者精细胞GSTT1和GSTM1基因研究 [J].中国免疫学杂志，2010，26（5）：425-427.

[10]陈文成，康熙雄，周亚莉，等.壮族人群少精不育患者雌激素β受体基因RsaⅠ多态性研究[J].中国计划生育学杂志，2010，18（2）：103-105.

[11]陈秉朴，黄瑞雅，韦叶生，等.壮族人群少精不育患者精子CYP1A2基因多态性研究 [J].重庆医学，2011，40（15）：1555-1556.

[12]Safarinejad MR，Shafiei N，Safarinejad S. Association of polymorphisms in the estrogen receptors alpha,and beta（ESR1,ESR2）with the occurrence of male infertilityand semen parameters[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2010，122 （4）：193-203.

[13]李俊，刘芳，宋亚曼，等.人鱼精蛋白1多态性与汉族男性生育力的相关性分析[J].中国现代医学杂志，2016，26（13）：48-51.

[14]Dumasia K，Kumar A，Deshpande S，et al.Estrogen,through estrogen receptor 1,regulates histone modifications and chromatin remodeling during spermatogenesis in adult rats[J].Epigenetics，2017，12（11）：953-963.

[15]Nanjappa MK，Hess RA，Medrano TI，et al.Membrane-Localized Estrogen Receptor 1 Is Required for Normal Male Reproductive Development and Function in Mice[J].Endocrinology，2016，157（7）：2909-2919.

[16]Zalata A，Abdalla HA，El-Bayoumy Y，et al.Oestrogen receptor alpha gene polymorphisms relationship with semen variables in infertile men[J].Andrologia，2014，46（6）：618-624.