胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术的应用是男性不育治疗的里程碑。该技术使精子无需穿透卵细胞放射冠、透明带及质膜这三大屏障，直接进入卵胞质内受精。然而，仍有1%～5%的ICSI患者可能发生完全受精失败（total fertilization failures，TFF），并可在后续的周期中重复发生。究其原因发现卵母细胞激活障碍（oocyte activation deficiency，OAD） 是ICSI受精失败的主要原因之一[1]。孤立的TFF事件可能只意味着获卵数过少或实验室条件的改变，而重复的TFF事件则提示存在严重的配子缺陷，从而导致OAD。本文将就OAD可能的原因及对策综述如下。

1 OAD的定义

卵母细胞激活是一个由众多环节组成的复杂过程，使得原本阻滞在第二次减数分裂中期（second metaphase，MⅡ）的卵母细胞转变为一个准备启动胚胎发育的受精卵。精卵质膜开始融合后，整个精子（除了质膜）逐渐被卵胞质吞没，卵母细胞激活从此启动。精子的出现随即引起卵母细胞内产生一种具有独特模式的Ca2+振荡。Ca2+振荡则将精细地编排此后的一系列事件，例如恢复第二次减数分裂、排出第二极体、释放皮质颗粒、重排细胞骨架、募集母系mRNA以及形成原核[2]。成功激活卵母细胞需要精卵密切合作，上述任何环节出现问题即可导致OAD。

2 OAD的原因

2.1 精源性因素

2.1.1 磷脂酶Cζ（phospholipases C zeta，PLCζ） 近年来，大量研究表明PLCζ与卵母细胞激活密切相关。Escoffier等[3]通过免疫金染色法在透射电镜下观察到PLCζ分布于精子赤道段和后顶体区的顶体内膜以及核膜上。在精子获能时，甚至是随后的顶体反应过程中，PLCζ仍完好保留在原有位置上。顶体反应后，精子的赤道段暴露，并开始与卵细胞质膜融合，PLCζ才得以扣动激活卵母细胞的“扳机”。PLCζ将卵细胞的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）水解为1，4，5-三磷酸肌醇 （inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和1，2－二酰甘油（diacylglycerol，DAG）[4]。水解产物IP3与其内质网上的受体（IP3receptor，IP3R）结合，使得原本储存在其中的Ca2+有节律地释放至胞质内形成Ca2+振荡，并通过一系列信号通路恢复减数分裂、释放皮质颗粒并最终形成原核。研究发现，在进行ICSI治疗的不育男性中，精子PLCζ的免疫荧光强度显著低于对照组。PLCζ的缺失、表达部位异常以及活性降低都与OAD有关，并导致临床上ICSI受精失败[5]。精子形态畸形也与PLCζ表达减少有关，其中最罕见也是最严重的情况就是圆头精子症[6]。

3.科技的研发与创新，使知识的学习将成为一种常态现象。以往员工在工作时，其只需具备了一项专门技能，就能更好的生存。而在未来，在知识经济影响下，这种现象将难以存在。其一是科技、信息更新速度太快，不存在绝对性优势，这些技术在今天可能属于领先性技术，但是在未来可能就会被淘汰。其二是很多有实力的企业都在注重科技研发和技术创新，很多技术在短时间内，就会被“攻破”，然后成为普遍性技术，比如当手机“全面屏”出来之后，很快基本上所有的手机都使用了这一技术。此外，学习的价值也更加重要，只有构建完善的学习体系，才能不被时代淘汰。

2.2.1 PIP2和IP3R PLCζ成功激活卵母细胞还需要经过一系列由PIP2、IP3R、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和Ca2+等物质参与的信号通路。其中，位于卵胞质内大量囊泡上的PIP2被PLCζ水解后开启了后续的信号通路，是卵母细胞激活必不可少的一步。囊泡上PIP2的数量减少可导致受精后无法产生Ca2+振荡。PIP2的水解产物IP3与内质网上的IP3R结合，使内质网上的配体门控通道发生构象改变，原本储存在其中的Ca2+得以释放到胞质内。Cooney等[18]发现IP3的数量受到了来自Ca2+水平精密的调控。受精后大量IP3出现，不可避免地导致了IP3R被下调。同时，正是因为IP3R依赖于IP3持续上升，Ca2+振荡的周期才能逐渐缩短直至消失。尽管IP3R对Ca2+振荡至关重要，人为地下调IP3R却不能完全阻止Ca2+振荡的产生。这说明卵母细胞可能还通过其他机制调控着Ca2+，或还有其他Ca2+的贮存点未被揭示。

2.2.3 Ca2+相关蛋白 维持卵母细胞Ca2+动态平衡依赖于钙池操控的钙内流，主要由基质相互作用分子1（stromal-interacting molecule 1，STIM1）和Orai1蛋白参与调控。IP3与受体结合后，Ca2+大量外流造成内质网内部Ca2+浓度下降。作为Ca2+浓度感受器的STIM1则迁移至卵膜，随即开放由Orai1构成的跨膜通道，卵细胞外的Ca2+得以内流，最终维持胞内Ca2+的动态平衡[20]。Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ由Ca2+振荡激活，通过一系列磷酸化等作用降解M期成熟促进因子，从而使得卵母细胞重新恢复第二次减数分裂。随着第二次减数分裂的结束，原核形成得益于同样由Ca2+振荡激活的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[21]。MAPK通路受损会抑制进一步的胚胎形成。

3.1 形态学选择性单精子卵胞质内注射（intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI） Ito等[22]研究发现精子的激活能力与其头部的平整度和是否存在核周膜物质有关，圆头精子和缺乏顶体后鞘和核周鞘的畸形精子基本无法成功激活卵子。IMSI可以对精子进行极其严苛的挑选，但不可避免形态正常的精子合并PLCζ或其他激活相关蛋白缺陷的情况。Luna等[23]报道尽管IMSI获得的胚胎质量和移植率与ICSI相比都有显著提高，但受精率和卵裂率并无显著差异。由此可见，卵母细胞激活的精源性因素仍存在无法提前用形态学方法辨别的情况，这时就需要利用其他方法来辅助激活卵母细胞或今后对策进行进一步研究。3.2 卵母细胞辅助激活（assisted oocyte activation，AOA） 对于有反复TFF病史的患者，AOA是目前公认的有效治疗手段，其方法分为机械激活、电激活和化学激活三大类。机械激活即在注射精子之前先用显微注射针尽量轻柔地多次抽吸胞质以促进卵母细胞激活。Ebner等[24]在ICSI时机械激活可使既往有TFF病史的患者获得53.6%的受精率和33.3%的妊娠率。目前，机械激活已被作为ICSI的常规操作。电激活即由直流电压产生的电场使得卵膜脂双层的蛋白带电荷而移动，继而形成一个微孔允许胞外的Ca2+内流，胞质内Ca2+浓度瞬时升高并激活卵母细胞。然而，电激活由于不能保证其安全性，未被应用于临床当中。化学激活剂有Ca2+载体、氯化锶、乙醇和6-二甲基苯胺嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）等，可单独使用，也可联合使用[25]。Ca2+载体A23187是研究和临床上最常用的激活剂，其可通过Ca2+的跨膜转运触发Ca2+内流，迅速产生单个Ca2+峰，促进卵母细胞激活。一项多中心前瞻性研究表示，对于既往有受精障碍的患者，使用Ca2+载体A23187辅助激活后受精率可达到48%，而对比传统ICSI周期的受精率仅为25%[26]。离子霉素是另一种常用的激活剂，Tavalaee等[7]对26例有DPY19L2基因缺失且PLCζ表达水平低的圆头精子症患者在ICSI后用离子霉素辅助激活卵母细胞，有效提高受精率的同时，得到了尚且合格的妊娠率和活产率。然而，这两种激活剂都只能激发产生单个瞬时的Ca2+峰，这与生理过程中的Ca2+周期性振荡不同，可能会改变Ca2+调控通路下游中特殊蛋白和酶的活性，影响胚胎形成和发育。虽然研究显示AOA并不会造成染色体异常或危及后代健康[26]，但AOA是否会对流产率和先天性畸形等造成影响仍亟待解答。

Tavalaee等[7]检测了32例由DPY19L2基因缺失导致圆头精子症患者的精子，发现PLCζ在RNA水平和蛋白水平的表达比可育男性显著降低。同时，不同国家的研究者们相继报道了多个PLCζ基因突变的病例。Heytens等[8]通过1例非圆头精子不育男性发现了PLCζ基因的2种常染色体点突变。H398P和H233L这两种突变分别影响PLCζ的Y和X结构域，从而导致蛋白催化功能下降。在此基础上，Kashir等[9-10]证明这种突变可由母系遗传致病。近年，Escoffier等[11]利用全外显子测序技术首次报道了针对C2结构域的纯合错义突变，PLCζ在卵母细胞激活中的关键作用被再次强调。自2002年PLCζ被发现以来，PLCζ基因缺失或失活的基因改造小鼠模型迟迟未被建立。直到最近，Hachem等[12]终于利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功制造出了上述2种小鼠。该研究显示这2种小鼠的精子均未能激发卵母细胞产生Ca2+振荡，这明确了PLCζ作为触发Ca2+振荡产生的“扳机”作用，最终导致卵母细胞受精。

2.2.2 PKC PKC是卵母细胞激活通路下游中不可或缺的一员，普遍存在于各类磷脂酰肌醇通路。PKC有3种亚型，即传统型（α、βⅠ、βⅡ和γ）、新型（δ、ε、η和θ）和非典型（ξ、ι和λ）。Halet等[19]利用双吲哚马来酰亚胺-Ⅰ抑制PKCα后直接导致了OAD。有趣的是，传统型PKC的分布会随着卵母细胞成熟和精卵融合而改变。受精后，PKCα由卵胞质内迁移到卵母细胞皮质。这种迁移被认为是除了Ca2+外，卵母细胞动力学激活的另一关键要素。PKCα的迁移使豆蔻酰化丙氨酸富C激酶底物磷酸化，于皮质部位拆散肌动蛋白网，使皮质颗粒到达卵膜并胞外分泌排出，阻止多精受精的发生。

2.1.2 后顶体WW区-结合蛋白（post-acrosomal WW-domain binding protein，PAWP） PAWP分布于后顶体鞘区的核周膜上，研究表明注射PAWP的mRNA和重组蛋白后，可以引起多个物种（包括人）的卵母细胞产生Ca2+振荡[13]。在临床上，PAWP的表达水平也与ICSI受精率以及胚胎发育情况密切相关[14]。Aarabi等[13]推测PAWP的PPXY区以一种非典型的方式与PLCγ的WW1号结构域相互作用，被激活的PLCγ随即水解PIP2，从而引起Ca2+振荡。PAWP一度被认为是PLCζ强有力的“竞争者”。然而，Nomikos等[15-16]注射PAWP却无法激发小鼠卵母细胞产生Ca2+振荡，并对PAWP间接水解PIP2以及体外激活卵母细胞的能力提出了质疑。Satouh等[17]建立PAWP基因敲除小鼠模型后发现，不但这些小鼠的精子仍然能成功激活卵母细胞，而且受精后胚胎可以正常地发育。所以，PAWP相比于PLCζ仍缺乏足够的科学证据明确其作为OAD精源性因素的作用和机制。

ICSI后重复发生的TFF主要由OAD引起，为了制定更合适的临床对策，筛查和明确病因格外重要。目前，尚无准确地评估卵子是否存在缺陷的方法与技术，而评估精子激活能力的方法如精子形态学、鼠卵激活实验和精子PLCζ的免疫荧光检测等有一定的作用，可作为OAD临床对策的依据，但也存在局限性。

3 OAD的对策

1.1.5 排除标准 ①综述文献；②动物实验文献；③个案报道；④重复发表或内容相似的文献；⑤原始文献非RCT；⑥无法从原始文献获得相应数据。

2.2 卵源性因素

近年来，黑龙江省初步形成了专项扶贫、行业扶贫和社会扶贫“三位一体”的精准扶贫体系框架，但在具体实施过程中仍存在诸多问题。

3.3 注射重组人PLCζ（recombinant human PLCζ，rhPLCζ） 在经历了ICSI受精失败后，Rogers等[27]向人卵胞质内注射不同浓度的人PLCζ mRNA，成功激发了与生理过程相似的Ca2+振荡。临床应用中，考虑到注射的mRNA可被逆转录为cDNA，并混入胚胎基因组，所以选择注射重组蛋白更为合适。Yoon等[28]首次将纯化的rhPLCζ注射进入未受精的人MⅡ期卵后，次日形成了一个单独的原核，48 h后发育为2-细胞胚胎，并通过荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization，FISH）验证了胚胎为单倍体。同时，Yoon等[28]将rhPLCζ注射进入ICSI后未形成雌雄原核的卵中，有62.5%的卵成功形成了雌雄原核。基于此人们首次提出一个类似于“补救ICSI”的概念——“补救PLCζ”，这对临床应用有巨大的启示作用。ICSI后卵母细胞激活失败可立即进行“补救PLCζ”，挽救受精结局。对于有受精失败史的患者，特别是只能寄希望于供精的TFF患者，rhPLCζ也可预防性地和精子一同注射入卵胞质内。然而，这项研究需要注射很高浓度的rhPLCζ才能诱导Ca2+释放，而且未能激发正确的Ca2+振荡。随即，Nomikos等[29]报道了一种更高效的纯化rhPLCζ，成功解决了上述两个难题，并发现PLCζ突变体的生育缺陷可通过利用rhPLCζ而获得改善，又一次推进了PLCζ走向临床应用的进程。

4 结语

OAD是目前辅助生殖技术中最棘手的问题之一，明确其发生的原因并寻找可靠的干预手段可以为ICSI后发生TFF患者缓解经济和心理上的负担。PLCζ和PAWP是OAD两个关键的精源性因素，PLCζ不仅能对OAD有一定的诊断价值，注射rhPLCζ可作为OAD的治疗手段。目前对于PAWP在OAD诊治中的作用仍存在争议，有待进一步深入研究。PIP2、IP3R、PKC和Ca2+相关蛋白等作为OAD的卵源性因素，介导了卵母细胞激活的一系列信号通路，任何环节出现异常都可能导致OAD，有的甚至能影响后续的胚胎形成。目前，AOA能有效地治疗OAD，其中钙离子载体的应用最为普遍，注射rhPLCζ也可作为治疗OAD的一剂“良药”。

本刊讯 12月9日至13日，省人大常委会党组副书记、副主任王良带队，省人大法制委员会会同常委会法工委和省政府有关部门，分三路到烟台、威海、潍坊、枣庄、德州、日照、临沂七市开展立法调研，听取对《山东省新旧动能转换促进条例（草案）》《山东省种子条例（草案）》《山东省精神卫生条例（草案）》的意见建议。

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