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高压氧对急性脑出血大鼠血浆降钙素基因相关肽及内皮素的影响

更新时间:2009-03-28

脑出血指原发性脑实质内的出血,是中老年人常见的急性脑血管病,有很高的发病率、致残率和病死率。脑出血后引起的病理生理过程复杂[1],包括血肿的占位损伤和血肿周围脑组织继发缺血引起的神经损伤[2]。此外,脑水肿、DNA氧化损伤导致脑细胞坏死和凋亡等[3-4]。传统的治疗方法以手术和药物为主,患者预后不理想。但随着高压氧疗法应用于脑出血、脑水肿等中枢神经系统疾病的临床治疗,不仅能消除水肿,而且能改善患者的神经恢复情况,提高预后效果[5-7]。但国内外关于高压氧对急性脑出血的治疗研究较少,所以本实验采用高压氧治疗急性脑出血大鼠,并观察高压氧对急性脑出血大鼠血浆降钙素基因相关肽(CGRP)及内皮素(ET)的影响,为临床安全应用高压氧治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠56只,平均体质量(200±25)g,8~10周龄,由陕西省医学实验动物中心供给,动物合格证号:SCXK(陕)2012-003。将大鼠随机分为急性脑出血组(分为脑出血后4、24、48 h亚组)、高压氧治疗组(分为治疗后4、24、48 h亚组),以及正常组,每组8只。

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1.2 实验器材 脑立体定向仪(江湾I型C);涡轮牙钻机(北京自动化仪表三厂提供);动物实验氧舱(陕西中心供氧);CY-4型测氧仪(浙江新安江分析仪器厂提供);LD24-0.8自动平衡微型离心机(上海精密仪器制造厂微型离心机);电热恒温水温箱(上海医疗器械七厂);氮氧混合气中氧浓度约为8.4%;上钢五厂气体公司提供医用纯氧(纯度99.2%)。

1.3 方法

教师提供资料:1910年5月,摩尔根果蝇室的大群野生型红眼果蝇中出现了一只白眼雄果蝇,对于这只后来在科学史上非常出名的昆虫,摩尔根使它与野生型红眼雌蝇交配而留下了后代。实验结果符合孟德尔分离定律,学生很容易得出果蝇的红眼和白眼受一对等位基因的控制。同时,部分学生也注意到了白眼性状的个体都是雄蝇。因此,教师提出问题:(1)为什么白眼果蝇都是雄性?(2)依据萨顿的假说,控制眼色的基因是否在与果蝇性别有关的染色体上?教师以问题引发学生思考,激发学生的探究热情。

今天晚上,浴在舞台照明的余辉里,连梁闰生都不十分讨厌了。大家仿佛看出来,一个个都溜了,就剩下梁闰生。于是戏继续演下去。

1.3.2 动物分组处理 正常组:置于加压舱内仿照除压力和氧浓度外的其他实验过程和环境条件,出舱后察看1 h后断头。急性脑出血组:急性脑出血后置于加压舱内仿照除压力和氧浓度外的其他实验,并分别于伤后4、24、48 h断头。高压氧治疗组:大鼠急性脑出血1 h后将大鼠置于提前放有新鲜钠石灰的动物加压舱内用纯氧气舱10 min使舱内氧浓度大于98%,以0.1 MPa/min的速度加压至0.25 MPa,在高压下停留1 h,中间间断用纯氧通风换气10 min,使舱内氧浓度维持在96.3%以上,停留结束后10 min内匀速减压至常压出舱,舱内温度维持22~24 ℃。正常组及急性脑出血组大鼠亦置于加压舱内,仿照除压力和氧浓度外的其他实验过程和环境条件并分别于颅脑出血后4、24、48 h断头[10]

2.5 各组大鼠皮层组织石蜡切片 正常大鼠脑组织皮质的切片图无异常显示;而无论是急性脑出血大鼠脑组织皮层切片图还是高压氧治疗后的急性脑出血大鼠脑组织皮层切片图,在一定程度上都显示有异常。见图1。

深松耕、免耕和常规耕作方式能够明显增加夏玉米生育期内0~10 cm土层土壤微生物生物量碳和微生物活性,土壤表现出“上富下贫”的现象。深松耕和免耕方式可以增加土壤含水量,增加土壤黏粒含量,有利于提高土壤的抗侵蚀能力。深松耕和免耕方式均能降低夏玉米生育期内土壤呼吸, 能够较好地改善土壤生态因子。

1.4 测定 将待测样本于冷水中复融,再次4 ℃,1 000 r/min离心5 min,采用非平衡法,取上清液分别测定ET和CGRP的水平。此外,取出浸泡在福尔马林溶液内的大脑皮质组织,做成常规石蜡切片,并做连续冠状切片,切片厚度4 μm,标记编号,完全晾干后,进行烤片,脱蜡。组织切片后进行组织学检查。

1.5 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析,计量资料采用组间比较采用单因素方差分析,用t检验,计量资料采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2

2.4 高压氧对急性脑出血大鼠血浆及皮层CGRP含量的作用 急性脑出血大鼠经高压氧治疗后4、24、48 h各组血浆及出血皮层CGRP含量与相应脑出血对照组比较有显著的提高,差异具有统计学意义(P<0.01)。而48 h组血浆及出血皮层CGRP含量最高但与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.3 高压氧对急性脑出血大鼠血浆及出血皮层ET水平的影响 急性脑出血大鼠经高压氧治疗后4、24、48 h各组血浆及出血皮层ET水平与相应急性脑出血组相比有明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.2 血浆及出血皮层CGRP水平在急性脑出血前后的变化 脑出血4、24、48 h各组大鼠血浆及出血皮层CGRP水平显著低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。脑出血后48 h组出血皮层CGRP水平最低,为(9.47±4.37)pg/mg,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

1.3.1 制备急性脑出血模型 经腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠,然后将其置于恒温垫上维持肛温37.5 ℃,同时将大鼠俯卧位稳定在脑立体定向仪上,前囟比后囟高1.2 mm,用75%乙醇给头背侧皮肤消毒,在耳朵与眼睛之间做一纵向切口,暴露颅骨,用棉签擦开软组织,确定前囟[8],在矢状缝向右3.2 mm,前囟后1.4 mm,用牙科钻钻一直径为1 mm的圆孔,以微量注射器笔直进针5.6 mm,定位于苍白球内,脑立体定向仪笔直位固定一微量注射器,使针头与牙科钻孔的方向在一条直线上,稳固好立体定向仪,取下微量注射器(留下针头)。将大鼠双下肢翻转朝上固定,尾根部腹侧暴露,消毒后在腹侧正中做一纵行切口,长2~3 mm,手术分离暴露大鼠尾动脉,在尾动脉下垫一手术刀柄,使动脉放于刀柄上,用盐水冲洗过的微量注射器穿刺尾动脉,抽取不加抗凝剂的动脉血液60~70 mL。迅速将微量注射器通过牙科钻孔垂直缓慢进入脑内,缓慢注入50 mL自体动脉血液,2 min缓慢地将溶液匀速注射完,留针5 min,退0.5 mm,再留针5 min后缓慢拔出针头,棉球清理干净手术切口,缝合皮肤并消毒[9]

 

1 急性脑出血后血浆和出血皮层中ET水平的变化

  

组别血浆(ng/L) 出血皮层(pg/mg) 正常组77.68±17.581.57±0.73脑出血后4 h组112.78±21.67*2.38±0.48*脑出血后24 h组116.53±37.89#2.49±0.57#脑出血后48 h组95.78±13.03#1.98±0.36#

注:与正常组比较,*P<0.01;与正常组比较,#P<0.05

2.1 血浆及出血皮层ET水平在急性脑出血前后的变化 大鼠急性脑出血后,血浆及出血皮层出血后4、24、48 h ET水平均显著高于正常组,差异有统计学意义 (P<0.05) 。其中脑出血后24 h组血浆及出血皮层ET水平最高,分别为(116.53±37.89)ng/L和(2.49±0.57)pg/mg,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

1.3.3 样本收集 各组大鼠在安静状态下迅速断头取主动脉血2 mL,注入含0.3 mol/L乙二胺四乙酸二钠40 μL和抑肽酶1 000 U的试管中,混匀,4 ℃,3 000 r/min离心10 min,分离血浆,取上清,放置-20 ℃保管待测。大鼠断头后,取脑出血侧大脑半球,浸入4%福尔马林溶液内固定,待用。

 

2 急性脑出血后血浆和出血皮层中CGRP浓度的变化

  

组别血浆(ng/L) 出血皮层(pg/mg)正常组384.35±89.4519.93±6.73脑出血后4 h组210.28±41.35*14.84±2.47*脑出血后24 h组215.56±91.38#10.78±2.86#脑出血后48 h组265.89±42.75#9.47±4.37#

注:与正常组比较,*P<0.01;与正常组比较,#P<0.05

 

3 高压氧对急性脑出血大鼠血浆及出血皮层ET水平的影响

  

样本急性脑出血组4 h24 h48 h高压氧治疗组4 h24 h48 h血浆(ng/L)117.45±19.65112.65±33.4696.27±11.1965.32±25.32#74.63±20.45#63.42±15.37#出血皮层(pg/mg)2.47±0.522.57±0.611.89±0.411.32±0.43*1.62±0.48*1.21±0.41*

注:与急性脑出血组出血皮层比较,*P<0.01;与急性脑出血组血浆比较,#P<0.05

 

4 高压氧对急性脑出血大鼠血浆及出血皮层CGRP水平的影响

  

样本急性脑出血组4 h24 h48 h高压氧治疗组4 h24 h48 h血浆(ng/L)218.32±39.42211.26±69.32265.45±41.35275.65±51.23#342.35±41.26#431.45±40.35#出血皮层(pg/mg)10.12±2.3211.32±4.4212.65±2.1313.35±1.86*14.35±2.35*20.35±2.36*

注:与急性脑出血组出血皮层比较,*P<0.01;与急性脑出血组血浆比较,#P<0.05

 

注:A为正常大鼠脑组织皮层切片图;B为急性脑出血大鼠脑组织皮层切片图(神经细胞水肿,出现空泡,包膜不完整,核固缩);C为高压氧治疗后的急性脑出血大鼠脑组织皮层切片图(神经细胞水肿减轻,形态变化基本恢复正常,细胞间隙变小)

1 大鼠脑组织皮层切片图

3

ET是作用最长效的血管收缩剂,是机体在病理状态下产生的内源性损伤因子,急性脑出血时ET水平会显著升高[11-13]。而CGRP在体内有显著的舒张血管的作用,主要分布于神经和脑血管系统,对脑血管功能的调节有重要作用。研究发现静脉滴注CGRP可降低血浆ET水平[14],说明CGRP对ET具有拮抗作用,为内源性的ET拮抗剂。急性脑出血导致局部脑组织缺血、缺氧,甚至神经细胞水肿、坏死,而高压氧因其氧含量高被应用于急性脑出血的治疗,并取得了一定的效果[15]。因此,通过研究ET和CGRP在急性脑出血时的表达水平,对分析高压氧治疗急性脑出血的临床作用有重要意义。

本研究结果显示,在急性脑出血后4、24、48 h,大鼠血浆及出血皮层ET水平较正常组有明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),且出血后24 h组ET表达水平最高,与组织形态学的变化一致,考虑可能与ET的强烈缩血管作用并导致组织的缺血、缺氧而造成的神经细胞损伤有关。而急性脑出血后4、24、48 h后大鼠血浆及出血皮层CGRP水平均较正常组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),且持续降低。此结果证明ET与CGRP参与了急性脑出血的病理生理过程,因此,急性脑出血后血浆ET和CGRP的表达水平能够反映脑组织的损伤程度。

脑出血后血浆和皮层ET的升高及CGRP的降低使脑血管舒张和收缩的调节、脑血流量的自身调节失衡,造成脑组织血流量及供氧减少,进一步加重了脑组织损伤[16-17]。实验发现急性脑出血后高压氧治疗可以明显升高血浆及出血皮层CGRP水平,同时使血浆及出血皮层ET水平显著降低。其机制为:(1)缺氧是诱发ET合成的一个重要环节,同时缺氧又可能导致CGRP释放的减少[18],高压氧可以纠正组织的缺氧从而抑制ET的合成并促进CGRP的释放。(2)高压氧可抑制ET升高所致的神经细胞突触对氨基酸的兴奋性和神经毒性的反应[7]。(3)高压氧可以增加脑缺血区域血流,降低脑水肿程度和代谢率,减少兴奋性氨基酸的产生和钙内流,并清除自由基。(4)缺氧可以导致血管对CGRP的反应性下降,而高压氧通过纠正缺氧可以提高血管对CGRP的反应性,改善组织的血供。笔者认为高压氧可以抑制缺血的脑血管平滑肌Ca2+内流,对抗ET的血管收缩,阻断其加重脑缺血缺氧的恶性循环,从而减少ET合成与分泌的增加,使缺血脑组织ET水平降低,同时高压氧可刺激组织细胞释放大量的CGRP进入血液循环,对脑血管的调节起到保护作用。

[19]王理万:《立法官僚化:理解中国立法过程的新视角》,《中国法律评论》2012年第2期,第119页。

综上所述,高压氧对急性脑出血引起的ET升高及CGRP的降低有显著的作用,是治疗急性脑出血的有效方法。

参考文献

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郑波
《国际检验医学杂志》2018年第10期文献

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