长链非编码 RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）是Okazaki等[1]在2002年最早发现的一类新的转录物，是广泛存在于哺乳动物细胞中的一类长度大于200 nt的非编码序列。近年来lncRNA FLA1被证实在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展相关。Hu等[2]对来自12种不同类型恶性肿瘤的2 394个样本的lncRNA进行全基因组分析发现，21.8%的样本出现体细胞拷贝数变异（somatic copy-number alterations，SCNAs），FAL1 的获得性SCNAs与恶性肿瘤患者存活率降低有关，且将FAL1定位于染色体1q21.2。Meng等[3]研究发现，lncRNA FAL1沉默24 h后，宫颈癌细胞株增殖能力减弱。石兴源等[4]在HeLa细胞中应用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默FAL1表达后应用CCK8法、Transwell侵袭实验证实FAL1可以促进HeLa细胞株的增殖、迁移及侵袭。Jeong等[5]对甲状腺乳头状癌组织、患者对侧正常甲状腺组织及正常人群甲状腺组织应用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术检测 FAL1的表达水平并进行分析，证实FAL1在甲状腺乳头状癌组织及癌细胞系中表达明显增高。而目前关于FAL1在卵巢癌中作用的报道较少。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号转导通路是调控细胞生长、增殖和分化的重要通路，其中细胞外信号调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）通路是MAPK系统的主要和经典信号通路，通过促有丝分裂信号传递到核内引起细胞增殖分化[6]。ERK1/2是MAPK信号转导通路的关键分子，可改变细胞核转录水平，促进细胞分裂并使细胞生存时间延长等，与多种肿瘤的发生、发展相关[7-8]。本研究着重探讨上皮性卵巢癌细胞中lncRNA FAL1的表达及其对上皮性卵巢癌细胞丝裂原细胞外激酶（mitogen extracellular kinase，MEK）/ERK 通路的激活、侵袭、迁移及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，qRT-PCR逆转录试剂盒购于瑞士Roche公司，Transwell小室购于美国BD Biosciences公司，转染试剂购于上海吉玛制药技术有限公司。MEK1/2 和磷酸化 MEK1/2（p-MEK1/2）、ERK1/2 和磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）抗体均购自美国Cell Signaling公司，卵巢癌细胞株（SKVO3）购于美国标准生物品收藏中心（ATCC）。上皮性卵巢癌组织选取2016年9月—2017年9月于哈尔滨医科大学附属第二医院住院手术切除的30例新鲜上皮性卵巢癌组织，组织学分类均为浆液性卵巢癌。正常卵巢组织取自因子宫肌瘤或子宫腺肌病于我院行全子宫及双附件切除术患者的30例新鲜正常卵巢组织。纳入标准：①所有入选卵巢癌患者术前均未接受过化疗、放疗或其他治疗；②所有实验组及对照组组织均经过病理检查，证实为上皮性卵巢癌或正常卵巢组织。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

第二，组织做好《条例》的宣传培训。按照干部职工牢固掌握、相关人员深入理解、社会公众了解支持的要求，在“六五”普法期间，深入开展《条例》的宣传。积极发挥新闻媒体、网络的作用，通过多种方式和途径在全流域广泛开展宣传活动，进一步增强全社会爱水、护水、节水意识和水法制观念，努力营造规模大、密度高、形式新的宣传氛围，确保广大干部群众深刻领会《条例》确立的基本原则、主要制度，准确把握《条例》的深刻内涵，增强贯彻实施的自觉性，保障《条例》的全面、顺利、有效实施，全面提升流域综合管理能力。

1.2 siRNA的设计和合成 根据GenBank提供的lncRNA FAL1序列设计并合成FAL1-siRNA、对照序列（FAL1-NC）及内参3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物序列。FAL1-siRNA正向引物序列为 5′-GCA AGC GGA GAC TTG TCT TT-3′，反向引物序列为 5′-TTG AAC TCC TGA CCT CGT GA-3′；FAL1-NC 正向引物序列为 5′-GCC GTC TAG AAA AAC CTG CC-3′，反向引物序列为 5′-ACC ACC TGG TGC TCA GTG TA-3′；GAPDH正向引物序列为5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′，反向引物序列为 5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′。引物均由上海吉玛制药技术有限公司提供。

2.1 lncRNA FAL1在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达 正常卵巢组织中lncRNA FAL1的相对表达量为2.93±0.39，卵巢癌组织中lncRNA FAL1的相对表达量为15.04±2.24。与正常卵巢组织相比，lncRNA FAL1在卵巢癌组织中的相对表达量明显上调，约5.13倍，差异有统计学意义（t=23.538，P=0.000）。

阿Q生活在辛亥革命前一个偏僻的农村未庄。他无家无室，贫无立锥之地，只能靠打短工为生。他割麦、舂米、撑船都会做，别人雇他干什么，他就干什么，过着饱一顿饿一顿的生活。他是一个很能劳动但极端贫困的流浪雇农。

2.2 lncRNA FAL1与卵巢癌细胞迁移能力的关系细胞划痕试验结果显示，FAL1-siRNA组SKVO3细胞迁移能力低于FAL1-NC组。FAL1-NC组SKVO3细胞迁移距离为（12.85±2.56）μm，FAL1-siRNA 组SKVO3细胞迁移距离为（6.68±1.49）μm，差异有统计学意义（t=15.763，P=0.002），提示 SKOV3 细胞转染FAL1-siRNA后迁移能力降低。见图1。

1.6 Transwell侵袭实验 Transwell小室置于24孔板中，在小室的聚碳酸酯膜上加入 4.0 μg/μL Matrigel基质 50 μL，置于细胞培养箱中过夜，使Matrigel基质胶凝固；在24孔板下室中加入500 μL含15%胎牛血清DMEM培养液，Transwell小室中加入150 μL SKVO3细胞悬液（转染12 h后的细胞，约1×105个）；48 h后，去除24孔板下室中的培养液，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，0.1%结晶紫溶液染色，室温静置5 min，显微镜下观察，每孔随机选取3个视野拍照，并记录每个视野的细胞数目。试验重复3次。

1.5 细胞划痕试验 SKVO3细胞转染12 h后，消化细胞，取处于对数生长期的细胞，接种于6孔板，每孔约5×105个，24 h后细胞汇合度达90%以上时，将移液器枪头垂直于孔板划出细胞划痕，每孔3条平行线，移出细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次。加入2 mL无血清培养基，同时在倒置显微镜下拍照，记为0 h的划痕宽度。置于细胞培养箱，24 h后再次拍照。试验重复3次。

1.7 流式细胞术 SKVO3细胞转染12 h后，消化细胞，用无血清培养基重悬细胞，调节细胞浓度为1×104个/mL。收集5×104个细胞加入100 μL Binding Buffer和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Annexin-V 5 μL，室温避光 15～20 min。再加入碘化丙碇（PI）5 μL，避光反应 5 min 后，加入 Binding Buffer，通过流式细胞仪进行检测。每组均设3个复孔，试验重复3次。

1.8 蛋白质印迹（Western blotting） 取对数生长期的SKVO3细胞，提取细胞蛋白，采用二辛可宁酸（BCA）法制作标准蛋白稀释浓度曲线，计算各组细胞蛋白浓度。取50 μg蛋白行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，将电泳产物转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白封闭1 h。分别加入一抗MEK1/2、p-MEK1/2、p-ERK1/2（浓度为 1∶2 000）和 ERK1/2（浓度为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜，再加入兔抗人远红外二抗DyLight 800室温孵育1 h，含0.05%吐温（Tween）的枸橼酸盐缓冲液（TBST）洗膜；用Odyssey红外扫膜仪扫膜显影并分析数据。试验重复3次。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。定量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义，检验水准α=0.05。

1.4 qRT-PCR（SYBR®Green） 收集 1×105细胞，加入 1mL Trizol，提取细胞总RNA。紫外分光光度计（美国Thermo公司）检测总RNA浓度及纯度（OD260/OD280比值介于1.0～2.0）。以1 μL总RNA为模板，分别准备模板-引物混合物，合成cDNA。qRT-PCR检测FAL1表达，反应条件：95℃变形15 s，60℃条件下退火并延长1 min，进行40个循环。PCR扩增结束后，收集荧光信号获得溶解曲线，确定扩增产物特异性。用2-ΔΔCt法表示 lncRNA FAL1 的相对表达量。

2 结果

1.3 细胞转染 取处于对数生长期的SKVO3细胞，接种于6孔板，每孔约2×105个细胞，培养14～18 h。采用脂质体将FAL1-siRNA及对照序列FAL1-NC分别转染至SKVO3细胞中，转染后细胞分别命名为FAL1-siRNA组（实验组）和FAL1-NC组（对照组）。

两组患儿治疗后临床疗效比较 见表1。两组患儿治疗后临床疗效比较,治疗组痊愈率和总有效率均有明显提高,差异具有统计学意义。

  

图1 细胞划痕试验检测细胞迁移能力（×40）

2.3 lncRNA FAL1与卵巢癌细胞侵袭能力的关系Transwell细胞侵袭实验结果表明，FAL1-siRNA组[（25.80±2.59）个]穿过Transwell小室底膜的细胞数目低于FAL1-NC组[（145.6±5.23）个]，差异有统计学意义（t=7.828，P=0.001），提示SKOV3细胞转染FAL1-siRNA后侵袭能力降低。见图2。

  

图2 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力（结晶紫染色×100）

卵巢癌是妇科最常见的三大恶性肿瘤之一，但相较于宫颈癌及子宫内膜癌，卵巢癌的死亡率一直居高不下，因临床确诊时一般已发展为晚期[9-13]。据统计，早期卵巢癌确诊病例5年生存率高达85%～90%，但是却有70%的卵巢癌患者确诊时已到临床晚期，而晚期患者5年生存率仅为25%～30%[14]。随着手术方式的发展和化疗药物的使用，晚期卵巢癌患者的5年生存率仍然相对较低，维持在40%左右[15]。卵巢癌组织学类型多种多样，其中以上皮性卵巢癌最为多见。大部分卵巢癌起病隐匿，无明显临床症状，晚期诊治方案单一，临床上一般以根治性手术辅以放、化疗，但效果差强人意。目前临床诊断卵巢癌最常用的方法，如影像学检查、血清肿瘤标志物检测等，对卵巢癌早期诊断的敏感度均较低，所以目前对卵巢癌的早期筛查与诊断仍是一个较大难题。因此，迫切需要确定新的生物标志物和治疗靶点来进行卵巢癌早期诊断及改善治疗策略。

  

图3 流式细胞术检测细胞凋亡

2.5 lncRNA FAL1对p-MEK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的影响 Western blotting结果显示，2组均有MEK1/2和ERK1/2蛋白的表达，FAL1-siRNA组p-MEK1/2和p-ERK1/2蛋白的相对表达量低于FAL1-NC 组，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示SKOV3细胞转染 FAL1-siRNA后，MEK1/2和ERK1/2蛋白磷酸化水平明显降低。见图4、表1。

  

图4 Western blotting检测卵巢癌细胞p-MEK1/2和p-ERK1/2蛋白表达情况

 

表1 lncRNA FAL1对卵巢癌细胞中p-MEK1/2和p-ERK1/2 蛋白表达的影响 （±s）

  

组别 n p-MEK1/2 p-ERK1/2 FAL1-NC 组 3 0.61±0.04 0.63±0.02 FAL1-siRNA 组 3 0.26±0.01 0.25±0.03 t（P）6.338（0.012）5.283（0.017）

3 讨论

2.4 lncRNA FAL1与卵巢癌细胞凋亡的关系 流式细胞术结果表明，FAL1-siRNA组[（18.38±0.73）%]细胞凋亡率高于FAL1-NC组[（2.86±0.09）%]，差异有统计学意义（t=24.969，P=0.000），提示 SKOV3细胞转染FAL1-siRNA后细胞凋亡率升高。见图3。

FAL1为近年发现的lncRNA，目前FAL1作用机制包括：①FAL1可以增强B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1（B lymphoma Mo-MLV insertion region 1，Bmi1）的稳定性，从而下调 p21 蛋白，最终导致卵巢癌细胞无限增殖。其中Bmi1是已知的原癌基因，国内外多项研究表明，Bmi1在恶性肿瘤中高表达，且其表达水平与恶性肿瘤的增殖和转移能力呈正相关[16-17]。②FAL1的扩增子中包含髓细胞白血病 1（myeloid cell leukemia-1，MCL1）基因，MCL1可抑制细胞凋亡，其表达失衡可导致肿瘤的发生，促进肿瘤生长，并促进肿瘤细胞产生对药物诱导的细胞凋亡的抵抗作用。③FAL1可抑制钙黏附蛋白 E（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达，从而降低细胞间的黏附作用，进而使肿瘤细胞的增殖能力及对周围组织的浸润能力增强。

本研究在一定程度上验证了lncRNA FAL1在卵巢癌中高表达。为了深入研究lncRNA FAL1在卵巢癌细胞的生物学功能，通过细胞转染外源性FAL1-siRNA，抑制卵巢癌细胞株中lncRNA FAL1的表达，细胞划痕试验发现沉默lncRNA FAL1的表达能够抑制上皮性卵巢癌细胞的迁移能力；流式细胞术结果表明，沉默lncRNA FAL1能够促进上皮性卵巢癌细胞的凋亡；Transwell侵袭实验结果显示，沉默lncRNA FAL1后上皮性卵巢癌细胞的侵袭能力明显降低。

抓好做实企业基层思想政治工作是一门大学问，如何灵活应用适当的方法，对确保思想政治工作的实效性至关重要。毛泽东曾以“过河”是用“桥”或“船”的问题作过生动比喻，深刻地说明了工作方式方法的重要性。

本研究通过沉默lncRNA FAL1后，p-MEK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平均较对照组明显减少，说明FAL1能够激活MEK/ERK信号通路，进而激活MAPK信号通路。卵巢癌的发生、发展及化疗耐药已被证实与Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的异常激活有关，其在肿瘤的增殖、侵袭、凋亡、肿瘤化疗耐药及浸润转移等方面发挥了重要作用，其异常激活可导致细胞凋亡功能的丧失、血管生成增加以及过度增殖，从而引起细胞的恶性转化，最终形成肿瘤。p-ERK是ERK的活性形式，持续激活的ERK通路可促进正常细胞向肿瘤表型转化[18]。Davidson等[19]发现p-ERK1/2和ERK在卵巢癌患者腹水中的阳性率分别是91%和98%，表明ERK1/2通路的激活与恶性肿瘤的发生、发展有关。提示p-ERK1/2可能与卵巢癌的发生与发展、恶性程度、侵袭、转移及化疗耐药有关，也可作为判定患者预后的指标之一。

呼吸系统包括呼吸道（鼻腔、咽、喉、气管、支气管）和肺。在呼吸系统感染的疾病中，“肺炎”只是患病部位最深的一种，而不一定是疾病病情最重的一种。

综上所述，本研究证实lncRNA FAL1能够通过活化p-ERK1/2及p-MEK1/2，激活MEK/ERK通路，参与卵巢癌的形成及转移。lncRNA FAL1可作为治疗上皮性卵巢癌潜在的药物作用靶点，为开发新的抗肿瘤药物提供了新思路和方向。

总之，我们应该充分利用文学课程得天独厚的各种地域资源，唤起学生热爱家乡的感情，进而激发引导他们的爱国主义热情，启迪他们的思想，陶冶他们的情感，使他们的乡土情怀和人文情怀得到升华。

参考文献

[1] Okazaki Y，Furuno M，Kasukawa T，et al.Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs[J].Nature，2002，420（6915）：563-573.

[2] Hu X，Feng Y，Zhang D，et al.A functional genomic approach identifies FAL1 as an oncogenic long noncoding RNA that associates with BMI1 and represses p21 expression in cancer[J].Cancer Cell，2014，26（3）：344-357.

[3] Meng F，Chen X，Song H，et al.LAPTM4B down regulation inhibits the proliferation,invasion and angiogenesis of HeLa cells in vitro[J].Cell Physiol Biochem，2015，37（3）：890-900.

[4] 石兴源，余宏伟，黄文瑾，等.沉默人宫颈癌细胞Hela中FAL1的表达对人宫颈癌细胞Hela增殖、侵袭及迁移的影响[J].中国现代医学杂志，2016，26（17）：34-38.

[5] Jeong S，Lee J，Kim D，et al.Relationship of Focally Amplified Long Noncodingon Chromosome1 (FAL1)lncRNA with E2F Transcription Factors in Thyroid Cancer[J].Medicine（Baltimore），2016，95（4）：e2592.

[6] Kim SK，Novak RF.The role of intracellular signaling in insulin-mediated regulation of drug metabolizing enzyme gene and protein expression[J].Pharmacol Ther，2007，113（1）：88-120.

[7] Song Y，Dai F，Zhai D，et al.Usnic acid inhibits breast tumor angiogenesis and growth by suppressing VEGFR2-mediated AKT and ERK1/2 signaling pathways[J].Angiogenesis，2012，15（3）：421-432.

[8] Dixon KM，Lui GY，Kovacevic Z，et al.Dp44mT targets the AKT,TGF-β and ERK pathways via the metastasis suppressor NDRG1 in normal prostate epithelial cells and prostate cancer cells[J].Br J Cancer，2013，108（2）：409-419.

[9] Ganeshan D，Bhosale P，Wei W，et al.Increase in post-therapy tumor calcification on CT scan is not an indicator of response to therapy in low-grade serous ovarian cancer[J].Abdom Radiol（NY），2016，41（8）：1589-1595.

[10]Jacobs AS，Schwartz MD，Valdimarsdottir H，et al.Patient and genetic counselor perceptions of in-person versus telephone genetic counseling for hereditary breast/ovarian cancer[J].Fam Cancer，2016，15（4）：529-539.

[11]Mandai M，Hamanishi J，Abiko K，et al.Anti-PD-L1/PD-1 immune therapies in ovarian cancer:basic mechanism and future clinical application[J].Int J Clin Oncol，2016，21（3）：456-461.

[12]Zhang Y，Hua W，Niu LC，et al.Erratum to:Elevated growth differentiation factor 15 expression predicts poor prognosis in epithelial ovarian cancer patients[J].Tumour Biol，2016，37（6）：8465.

[13]Claussen C，Rausch AV，Lezius S，et al.Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer[J].Thromb Res，2016，141：39-48.

[14]Jelovac D，Armstrong DK.Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer[J].CA Cancer J Clin，2011，61（3）：183-203.

[15]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[16]Guo BH，Feng Y，Zhang R，et al.Bmi-1 promotes invasion and metastasis,and its elevated expression is correlated with an advanced stage of breast cancer[J].Mol Cancer，2011，10（1）：10.

[17]Liu W，Feng JQ，Shen XM，et al.Two stem cell markers,ATP-binding cassette,G2 subfamily (ABCG2)and BMI-1,predict the transformation of oral leukoplakia to cancer:a long-term follow-up study[J].Cancer，2012，118（6）：1693-1700.

[18]Brinkkoetter PT，Olivier P，Wu JS，et al.Cyclin I activates Cdk5 and regulates expression of Bcl-2 and Bcl-XL in postmitotic mouse cells[J].J Clin Invest，2009，119（10）：3089-3101.

[19]Davidson B，Givant-Horwitz V，LazaroviciP，etal.Matrix metalloproteinases (MMP),EMMPRIN (extracellularmatrix metalloproteinase inducer)and mitogen-activated protein kinases(MAPK):co-expression in metastatic serous ovarian carcinoma[J].Clin Exp Metastasis，2003，20（7）：621-631.