0　引言

α-细辛脑（asarone），即（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲（Acorus tatari⁃nowii）的主要有效成分之一，又名α-细辛醚，可用于止咳、化痰、平喘，对肺炎、慢性气管炎均有较好的疗效［1］.α-细辛脑熔点低、脂溶性强，制成生物利用度高的口服固体制剂有一定困难［2］.

鱼种经过一段时间的养殖后会出现规格大小不均匀的现象，需要分筛过塘养殖商品鱼，增加鱼苗的成活率。一般鱼苗达到十一二朝时分塘，过筛要求手要轻，全程操作鱼苗都不要离水操作，避免过度伤鱼，过塘后造成鱼苗大量死亡，在起捕前可以向养殖池塘泼洒应激药物，如速解安和激活按1：2搭配使用，可以减少鱼苗的应激，同时为了更好减少鱼苗到新的养殖环境不适应，可以在即将投放的池塘泼洒解毒护水精华，每亩400mL。

脂质体是临床应用较多的药物靶向传递系统之一［3］，但普通脂质体大多数情况下以混悬液的形式存在，长时间存放不稳定，易发生分层、凝聚、沉降、分解、药物渗漏等情况［4］.前体脂质体（prolipo⁃somes）是将脂质体膜材和药物的混合液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表面，从而形成自由流动的粉体状制剂即为前体脂质体［5］，可解决普通脂质体存在的凝聚、渗漏等问题［6］.国内外学者对前体脂质体的制备和质量评价都进行了深入研究［7-8］，除本课题组前期制备的α-细辛脑前体脂质体之外［9-10］，目前鲜见其他关于α-细辛脑前体脂质体的报道.本文在课题组前期制备的基础上，采取Box-Behnken Design-响应面优化法（BBD-RSM）［11-12］，优化了α-细辛脑前体脂质体的制备工艺，考察了前体脂质体的稳定性及体外释放度，为把α-细辛脑前体脂质体开发成新药打下良好的基础.

1　材料与仪器

1.1　药品与试剂

α-细辛脑（广西亿康药业，批号080626，含量98.6%）；胆固醇（AR，国药集团试剂公司）；卵磷脂（AR，德国利宝益）；甘露醇（AR，国药集团试剂公司）；甲醇（色谱纯，国药集团试剂公司）；维生素E（AR，国药集团试剂公司）；其他试剂均为分析纯.

1.2　仪器

Agilent-1260型高效液相色谱仪（Agilent）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）（Agilent）；Millipore超纯水仪Direct-Q3 UV（默克化工技术有限公司）；EYELA N-1300v-WB旋转蒸发仪（岛津公司）；Microcon YM-50离心超滤管（50 kDa，0.5 mL，美国Milipore）；智能溶出度测试仪RC-3（天津市新天光分析仪器技术有限公司）等.

2　方法与结果

2.1　α-细辛脑前体脂质体的制备工艺

在本课题组前期实验的基础上［9-10］，甘露醇载体沉积法制备α-细辛脑前体脂质体.称取处方量的α-细辛脑、胆固醇、卵磷脂溶于无水乙醇中，称取少量维生素E溶解于上述无水乙醇中（维生素E与卵磷脂重比为1∶50），超声分散获得类脂质澄明溶液.然后称取处方量的甘露醇粉末加入上述类脂质溶液于旋转蒸发仪减压蒸干，干燥即得α-细辛脑前体脂质体.

2.2　α-细辛脑含量的测定［9］

式中，x1为游离药物的浓度，x0为脂质体中药物总浓度.

独立学院法学专业在人才培养上以市场为导向，以实用为落脚点。因此，要努力创新适合独立学院法学专业学生发展的教学质量评价体系。这一评价体系“必须要考虑学校的办学定位及人才培养定位，教师评价的重点及方式应该与学校的定位、发展战略、人才培养类型等相适应。”［3］

α-细辛脑在20～100 μg/mL范围内与峰面积Y呈良好的线性关系，回归方程Y=41.49 x+16.38（r=0.9903）；相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）为0.44%（n=5）；低、中和高3种剂量平均回收率分别为99.05%、101.20%和101.50%，RSD分别为1.44%、0.69%和0.80%（n=3），符合试验测定要求.

2.3　脂质体包封率的测定

在本课题组前期实验的基础上［11］，选3个对包封率影响较大的因素为自变量：卵磷脂用量（A）、卵磷脂与胆固醇重比（B）、卵磷脂与α-细辛脑重比（C），采用Dseign-Expert 8.0.6.1软件进行试验设计，以包封率（E）为响应值，共设计了17组试验，因素水平见表1，测定结果见表2.

 

色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB－C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－水（65∶35，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长：313 nm；进样量：20 μL；柱温30℃.

 

表1　Box-Behnken因素水平Tab.1 Box-Behnken factor level

  

因素水平C A/g B-10　10.51.52.53　6　9102540

2.4　BBD-RSM优化α-细辛脑前体脂质体试验

称取α-细辛脑前体脂质体固体粉末溶解在生理盐水中得一定浓度的α-细辛脑前体脂质体混悬液，经破乳、过膜、离心后可得细辛脑前体脂质体离心液和混悬液，加甲醇溶解定容.精密量取20 μL注入高效液相色谱仪，计算药物总浓度（x0）及离心液中游离药物浓度（x1），根据下式计算药物包封率［10］（E）.

2）再如“chez moi”这一短语，法语中chez是介词，和重读人称代词（即英语的宾格）搭配，表示“在某人家里”；而在英语中则不存在“介词+宾格”表示“在……家里”的短语，所以对句子“je me retiray chez moy”进行字对字翻译为“I myself retired to me”，“chez moy”字对字只能译作“to me”，实际翻译需补充为“to my place”或“to my house”。

 

表2　Box-Behnken设计实验结果Tab.2 Box-Behnken design result

  

试验号BC 1　2　3　4　5　6　7　8　9　1011121314151617 A/g 0.001.00-1.000.000.001.001.000.000.001.00-1.000.000.000.00-1.000.00-1.000.000.000.000.000.00-1.001.000.00-1.000.000.001.00-1.000.00-1.001.001.000.001.001.000.000.000.000.000.001.00-1.00-1.00-1.00-1.000.000.001.000.00 E/%93.4588.6184.5692.1591.3582.9889.8792.1385.0485.8775.2784.1378.6792.8779.7684.1282.09

2.5　响应面法优化α-细辛脑的实验结果及模型拟合

采用Dseign-Expert 8.0.6.1对表2的数据进行分析，模型的方差分析表见表3，得二次多项式回归方程Y=92.39+3.21 A+1.72 B+2.30 C+1.14 AB-1.64 AC-1.69 BC-4.06 A2-4.65 B2-4.75 C2（R2=0.9767，P＜0.0001，F=32.56，失拟度检验p=0.0936＞0.05，F=4.38）.

软件预测的最佳卵磷脂质量1.90 g，卵磷脂与胆固醇重比6.63∶1，卵磷脂与α-细辛脑重比为27.08∶1.该软件预测的优化包封率为93.36%.根据实际实验情况，在卵磷脂质量1.90 g，卵磷脂与胆固醇重比6.6∶1，卵磷脂与α-细辛脑重比为27.1∶1的条件下进行模型的验证实验，实验结果表明：α-细辛脑平均包封率为94.53%.该结果表明：该优化工艺稳定可靠，实验值与建立的模型预测值基本一致.

 

表3　方差分析Tab.3 Analysis of variance

  

注：P＜0.05为显著水平，P＜0.01为极显著水平.

 

方差来源模型自由度A　B　C　A B AC BC A2　B2　C2 F值32.5652.4215.0826.943.316.846.4944.3258.0660.52 P值＜0.00010.00020.00600.00130.11150.03470.03830.00030.00010.0001残差失拟值纯误差总和R2=0.9767平方和459.7382.2423.6742.275.2010.7310.1869.5391.0994.9510.988.422.56470.719　1　1　1　1　1　1　1　1　1　7　3　4　164.380.0936 R2adj=0.9467

由表3可知试验设计所选择的3个因素（A、B、C）对α-细辛脑包封率均有显著的影响，其中AC、BC对α-细辛脑包封率也有显著的影响.模型F值较高（32.56），P＜0.0001，说明拟合模型高度显著；失拟项F值较小（4.38），P＞0.05，失拟项不显著，该模型的信噪比高（16.608），方程的决定系数R2=0.9767＞0.95，表明实测值与预测值之间有高度的相关性；其校正决定系数R2adj为0.9467，表明模型响应值的变化有94.67%来源于所选自变量，说明模型在回归区域拟合良好，符合实验要求，可用该回归模型对实验结果进行统计分析［13］.

2.6　参数优化及模型预测

为确定α-细辛脑的最佳制备优化工艺，构建了三维曲面图，图1—图3显示了影响α-细辛脑包封率的自变量及交互影响.

  

图1　卵磷脂用量及卵磷脂与α-细辛脑重比对包封率的等高线及响应面Fig.1 The contour and 3D response surface of the entrapment efficiency on phospholipid and phospholipid：α-asarone

图1示出了在固定的卵磷脂与胆固醇重比（B）条件下，α-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与α-细辛脑重比（C）的交互影响.随着A和C的增加，响应值α-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂用量（A）为1.90 g时α-细辛脑包封率最高，分析可能的原因为：随着卵磷脂量的增加，磷脂所形成的脂质双分子层包裹的药物增加，从而包封率增加，但卵磷脂量继续增加，双分子膜的通透性和不对称性也会增大，可能导致药物渗漏增多从而包封率下降［13］.

  

图2　卵磷脂与α-细辛脑重比及卵磷脂与胆固醇重比对包封率的等高线及响应面Fig.2 The contour and 3D response surface of the entrapment efficiency on phospholipid：α-asarone and phospholipid：cholesterol

图2示出了在固定的卵磷脂用量（A）条件下，α-细辛脑包封率在卵磷脂与胆固醇重比（B）及卵磷脂与α-细辛脑重比（C）的交互影响.随着B和C的增加，响应值α-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂与胆固醇重比（B）为6.63∶1时，α-细辛脑包封率最高，过低的胆固醇浓度会影响脂质体成膜，胆固醇量增加，膜中双分子排列的紧密程度也增加，从而起到稳定双分子膜的作用，但是胆固醇量继续增加可能会使脂质体膜的刚性也增加［14］，总表面积减少，所包裹的药物量减少，从而包封率降低，胆固醇量的增加也会影响脂质体的稳定性［14］.

比较以上相关系数的绝对值，可知zNormal>zGumbel(max)>zBeta>zGumbel(min)>zLognormal>zWeibull，6个函数中，厦门港的进港集装箱船舶分布与Normal(正态分布)函数相关程度最高，故之后将采用正态分布函数来表示2016年厦门港的进港集装箱船舶数据分布。

  

图3　卵磷脂用量及卵磷脂与胆固醇重比对包封率的等高线及响应面Fig.3 The contour and 3D response surface of the entrapment efficiency on phospholipid and phospholipid：cholesterol

在同学们惊讶的眼神中，我严肃认真地宣读了检讨书。“首先，我对小李同学的生活关心不够，在此我对小李表示歉意，我将把同学们对于学校食堂的意见和建议及时反馈给总务部门。其次，我对同学们的安全教育不够，表示深深的歉意，在宿舍内违规使用大功率电器，不仅是浪费电的问题，更重要的是，容易引起火灾，危及我们的生命安全。再次，我对同学们的了解还不够，同学们对我还不够信任，和谐的师生关系有待于进一步建立，请同学们给我时间，我会走到每一个同学的身边，做同学们的知心朋友……”我读完检讨书后，同学们都热烈地为我鼓掌。

陈颐磊脱下军帽，对着衢州方向深深地一鞠躬，那些无法带出，遗留在孔庙的几百名重伤员是他军旅一生永远无法忘记的痛。

图3示出了在固定的卵磷脂与α-细辛脑重比（C）条件下，α-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与胆固醇重比（B）的交互影响.随着A和B的增加，响应值α-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面。由图1—图3可以看出，图1—图2的3D图坡度比图3陡，这说明AC、BC交互作用对α-细辛脑包封率的影响比AB大，这与表3方差分析的结果一致.

2.7　脂质体稳定性的考察

将制备的α-细辛脑前体脂质体固体粉末1 g置于封口袋中，α-细辛脑前体脂质体固体粉末1 g溶解后置于具塞试管中，每组设3个平行，将其分别放在层析柜（4℃）和室温（25℃）保存6个月，分别在1、2、3、4、5、6个月时取样进行渗漏率和包封率的测定.包封率的测定按照式（1）进行，渗漏率的测定按照式（2），稳定性实验结果如表4所示.

 

式中，E0为未放置之前的药物的包封率，E1为放置一段时间之后的包封率.

由表1的结果可知，α-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃下放置6个月比较稳定，25℃放置6个月之后的渗漏率仍在10%之内.而25℃下α-细辛脑前体脂质体溶液渗漏率到第3个月已经达到20.74%，之后脂质体水溶液开始出现絮状沉淀，随着时间的延长絮状沉淀开始发黑，说明脂质体已经发生霉变和絮凝，而在4℃条件下无论脂质体的粉末还是水溶液都没有出现霉变和絮凝的状态.结果表明：α-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定.

 

表4　α-细辛脑前体脂质体稳定性实验结果Tab.4 The results of the stability of α-asarone proliposome %

  

时间第1个月第2个月第3个月第4个月第5个月第6个月4℃放置α-细辛脑前体脂质体固体粉末渗漏率0.791.071.211.451.621.884℃放置α-细辛脑脂质体溶液渗漏率1.183.594.676.098.2410.4525℃放置α-细辛脑前体脂质体粉末渗漏率1.222.844.296.048.279.3425℃放置α-细辛脑前体脂质体溶液渗漏率6.9815.6320.74—　—

2.8　体外释放度的考察

  

图4　α-细辛脑前体脂质体的释药曲线Fig.4 Release curve of α-asarone Proliposomes

取3批α-细辛脑前体脂质体的固体粉末溶解在生理盐水中，参照中国药典2015版溶出度的测定法——转篮法，以人工胃液（900 mL）为溶出介质，37℃下恒温振摇，100 r/min转速下每间隔1 h取样（同时补足等量人工胃液）、稀释、过膜注入高效液相色谱仪，进行α-细辛脑含量的测定［9］，计算累计释放率（3批样品平均值）.以时间为横坐标，样品各时间点的累积释放率为纵坐标绘制曲线，如图4所示.由图可知，在0～12 h内药物释放速度相对缓慢，12 h累积释药量90.21%.说明自制的α-细辛脑前体脂质体具有一定的缓释作用，能够为临床提供相对平稳的血药浓度，减少副作用的发生及给药次数.

将α-细辛脑的累积释放度（Mt/M∞）或待释放度（1－Mt/M∞）与时间（t）分别按零级方程、一级方程和Higuchi方程进行拟合，其零级拟合方程：Mt/M∞=0.0665 t+0.2331，r2=0.8841；一级拟合方程：ln（1-Mt/M∞）=-0.1988 t-0.0746，r2=0.9504；Higuchi拟合方程：Mt/M∞=0.2723 t1/2+0.0196，r2=0.9921.结果表明Higuchi方程拟合的相关系数最大，R2＞0.99，因此采用Higuchi拟合的方程相关性最好.

3　结论

前体脂质体是指将脂质材料吸附于载体上制备成的粉末状制剂，可提高制剂的稳定性，避免了用传统方法制备脂质体所存在的问题［6］.本研究采用载体沉积法制备α-细辛脑前体脂质体，以卵磷脂、胆固醇为膜材，甘露醇为载体，以包封率作为评价指标，采用Box-Behnken Design-响应面法对工艺条件进行优化，优化后的最佳工艺条件：卵磷脂质量1.90 g，卵磷脂与胆固醇重比6.63∶1，卵磷脂与α-细辛脑重比为27.08∶1.α-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定，其体外释放规律符合Higuchi方程.该优化工艺稳定可靠，α-细辛脑前体脂质体固体粉末可在室温条件下贮存，其在体外具有良好的缓释作用.

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