木薯（Manihot esculentaCrantz）别名树薯、番薯，属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）多年生灌木，是在热带亚热带地区广泛栽培的一年生作物，具有高淀粉、易种植、耐瘠、抗逆、收获时间灵活等多种优点。木薯不仅是一种重要的粮食作物，还是一种重要的工业原料作物[1]。木薯遗传背景复杂，具有基因型高度杂合、花期不遇、种子发芽率低和有性子代性状严重分离的特性[2]，使得其传统育种受到一定限制。生物技术育种是传统育种方法的一种补充手段。随着细胞工程和基因工程的发展，生物技术育种越来越显示了其相对于传统育种方法的优势，而组织培养再生技术是木薯生物技术的重要组成部分。目前，木薯已建立的再生体系主要有四种：器官发生途径、体细胞胚发生途径、脆性胚性愈伤再生和原生质体再生[3]。木薯原生质体再生植株也是其中重要一种。

木薯作为一种粮食作物，其原生质体再生存在较大困难，其研究也落后于水稻、玉米、小麦等其他粮食作物。Shahin和Shepard用木薯叶片分离原生质体并培养，再生了植株[4]，但其他学者却不能重复这个过程[5-6]。因此，我们一般认为木薯叶肉原生质体不能再生完整植株。目前，木薯愈伤原生质体再生植株的研究也只有两例，并且均是木薯品种TMS60444的胚性愈伤组织及其悬浮系分离的原生质体。1998年，Sofiari等由TMS60444愈伤组织分离的原生质体，经培养再生了植株，但是由原生质体分裂生长而成的愈伤组织分化成成熟胚效率低，并且成熟胚萌发效率也低，是木薯原生质体再生植株的瓶颈[6]。此后一段较长的时间没有木薯原生质体再生的研究报道。2012年，文峰等在Sofiari等的研究基础上，在胚状体发生过程中，先悬浮培养，再在MSN培养基[7]上光照培养，原生质体再生效率有较大提高，建立了完整有效的木薯脆性愈伤原生质体再生体系[8]。木薯原生质体再生作为一种重要的再生手段，其影响因素较多。本文是在我们已建立的木薯原生质体再生体系的基础上，总结归纳了木薯原生质体在再生过程中的四种重要影响因素，包括分离原生质体的脆性胚性愈伤组织的状态、原生质体提取与纯化的方法、培养原生质体的培养基、胚状体的分化与萌发，为今后木薯原生质体分离、培养、原生质体融合再生、原生质体转化再生等研究提供技术指导和借鉴。

1 影响木薯原生质体再生植株的因素

1.1 脆性胚性愈伤组织（FEC）的状态

分离高质量的原生质体是进行原生质体培养的先决条件，而脆性胚性愈伤组织的状态直接影响到分离的原生质体的质量，包括产量和活性。木薯胚性愈伤组织的状态以酥松、松脆为最好，具体表现为落入SH液体悬浮培养基 [7，9]中以细小颗粒状分散开。胚性愈伤组织在GD培养基 [7，10]中继代增值15～20 d时，可达到这种状态。胚性愈伤组织，经过悬浮培养，利用悬浮系分离原生质体，有利于植株再生，此方法已成功应用在水稻、小麦、甘蔗、玉米等多种作物的原生质体再生植株过程中。木薯脆性胚性愈伤组织悬浮系在继代5～15 d时，分离的原生质体杂质少、活性高，继代超过15 d，分离的原生质体所含杂质相对较多[8]。

海西州委常委、格尔木市委书记王勇说，格尔木依托柴达木盆地得天独厚的生态优势，积极发展有机枸杞产业，建成全省首个国家级生态原产地产品保护示范区，获颁我国首张有机枸杞认证证书，出口和创汇位居全省农产品之首，枸杞产业成为拉动农牧业经济持续增长的引擎。

1.2 原生质体提取与纯化方法

酶液分离的木薯原生质体，需提取和纯化，其中酶液过滤是非常关键的一步。酶解的酶液在经过不锈钢筛网过滤时，可能是由于液体表面张力的作用，酶液很难自动流下，而原生质体在酶液中停留时间越长，活性越低，产量越少，杂质越多，所以要尽快让酶液经过不锈钢筛网过滤，这时可以给不锈钢筛网一个外力，如用无菌的镊子轻敲不锈钢筛网促进酶液过滤。过滤后的酶液采用梯度离心法[8]纯化原生质体，可得到大量高活性的原生质体。

通过对月亮湾的使用性质、交通组织、公共空间和建筑四大类指标在实施前后的对比研究（见表1）发现，土地的使用性质和各类功能的比例是刚性规划，不可改变，而交通组织与公共空间则会发生改变。对于具体指标而言，交通组织中有无停车场、地块整体面向市政道路的出入口位置和数量是刚性规划，而停车场的位置和地下停车场出入口的具体位置是弹性规划。公共空间中的后退红线是刚性规划，具体景观风格，绿化带位置、宽度等是弹性规划。建筑中塔楼与裙房的限制高度、骑楼和永久性建筑的有无是刚性规划，具体位置、景观带位置和空间营造方式是弹性规划。

1.3 原生质体培养基

木薯原生质体采用TM2G培养基液体浅层培养，培养密度为5×105个/mL，TM2G培养基中葡萄糖的起始浓度可在0.30～0.36 mol/L范围内[8]，此后需不断更换新鲜培养基并适当降低葡萄糖浓度才能促进细胞团的分裂和生长。原生质体在TM2G培养基中培养1～2个月后，将肉眼可见的1～2 mm的致密愈伤组织挑出，其他继续培养。

1.4 胚状体分化与萌发

Sofiari等认为木薯原生质体起源的愈伤组织分化成胚状体及胚状体萌发，是木薯原生质体再生植株的瓶颈[7]，所以胚状体发生是关键的一步，而培养基是重要的影响因素。因木薯原生质体起源的致密愈伤组织状态与用作转化的脆性胚性愈伤组织状态一致，都是细胞团，所以采用转化过程中使用的MSN培养基作为分化胚状体的培养基。在MSN培养基分化胚状体之前，致密愈伤组织先在SH液体悬浮培养基中悬浮培养2～4周，能促进愈伤组织增值，增殖速度比直接在MSN固体培养基上培养增殖快，效果更好，并且悬浮后的致密愈伤组织的胚状体分化能力比直接在MSN固体培养基上的致密愈伤分化能力强，且更有利于胚状体萌发。所以，在胚状体发生过程中，原生质体起源的致密愈伤组织先悬浮培养，然后在MSN培养基上培养，提高了胚状体的分化和萌发能力。此后的萌芽伸长、生根的再生过程都与体细胞胚胎发生的再生过程一样，而体细胞胚胎发生的再生过程已有很多报道了[11-13]。

2 结语

木薯原生质体培养和再生是一个较长的过程，一般再生成完整植株需要6-7个月。整个原生质体操作过程中都需要小心、细致的操作。原生质体培养和植株再生技术是植物细胞工程、基因工程的基础。这里总结归纳了木薯原生质体再生过程中的重要影响因素，也是木薯原生质体整个再生过程中的重点和难点，分享了原生质体再生过程中的一些经验和小技巧，为木薯原生质体再生提供技术指导，为木薯组织培养提供有益的启发与参考，也为生物技术改良木薯品种奠定基础。

参考文献

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[3]文峰，苏文潘，黄建祺，等．木薯再生体系建立的研究进展[J]. 安徽农业科学，2017，45(8)：156-158.

[4]Shahin E A，Shepard J F.Cassava mesophyll protoplasts: isolation，proliferation and shoot formation [J].Plant Science Letters，1980，17:459-465.

[5]Anthony P，Davey M R，Power J B，et al.An improved protocol for the culture of cassava leaf protoplasts[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture， 1995， 42:229-302.

[6]Sofiari E，Raemakers C J J M，Bergervoet J E M，et al.Plant regeneration from protoplasts isolated from friable embroygenic callus of cassava[J].Plant Cell Reports，1998，18:159-165.

[7]文峰，苏文潘，郑华，等．木薯组织培养中常用培养基简介[J]．农业研究与应用，2017，2：71-74.

[8]文峰，肖诗鑫，聂扬眉，等．木薯脆性胚性愈伤组织原生质体培养与植株再生[J]．中国农业科学．2012，45(19)：4050-4056.

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