结肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年新增病例超过100万，居我国常见恶性肿瘤病死率第5位[1]。伊立替康属于拓扑异构酶Ⅰ(Top Ⅰ)抑制剂，是结肠癌的一线化疗药物之一，但由于易产生耐药性而导致化疗失败[2]。因此，从天然中药有效成分中筛选出新的抗结肠癌药物具有重要意义。氯化两面针碱(nitidine chloride，NC)是从芸香科花椒属植物两面针[Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.]的干燥根中提取得到的一种活性生物碱，具有良好的广谱抗肿瘤活性[3-7]。NC在体外能够抑制结直肠癌HCT116细胞增殖并诱导细胞凋亡，其分子机制与ERK信号通路有关[8]，提示NC在结肠癌的治疗方面具有良好的应用前景。尽管如此，有关NC诱导结肠癌细胞凋亡的分子机制的研究仍然不够充分。

已有研究表明，NC能够显著抑制拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ(TopⅠ和TopⅡ)的催化活性，损伤DNA，引起肿瘤细胞凋亡[9-10]。此外，NC可富集在人肺癌细胞线粒体内，诱导细胞阻滞于G0/G1期[11]。由此可知，肿瘤细胞线粒体是NC作用的主要靶标细胞器之一。然而，线粒体凋亡途径在NC诱导的人结肠癌细胞凋亡中的调控作用目前尚无文献报道。因此，本研究旨在探讨NC对人结肠癌HT29细胞增殖和凋亡的影响，以及对细胞色素c(Cyt-c)信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药物及主要试剂 HT29细胞购自中国科学院上海细胞库。NC(纯度≥98%，天津中新药业研究中心，批号：W08-2-3)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；Mccoy’s 5A培养基(美国Sigma-Aldrich公司)；Cell Counting Kit-8(上海尚宝生物科技有限公司)；南京凯基Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒；Cyt-c(美国Cell Signaling Technology公司)；caspase-3 Antibody(美国Cell Signaling Technology公司)；Tublin(美国EarthOX Life Sciences公司)；IRDye® 680RD 羊抗兔IgG (H+L)二抗(美国LI-COR公司)。

1.2 HT29细胞的培养和传代 HT29细胞在含10%胎牛血清和1%青—链霉素的Mccoy’s 5A培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养，每天换取新鲜培养基。显微镜下观察细胞长满约80%，吸尽培养基，用无菌HBSS缓冲液洗净培养瓶，每个培养瓶加入0.25%胰酶溶液+0.02%EDTA消化液0.5 mL，显微镜下观察见细胞收缩、细胞间隙变宽，加入完全培养基2 mL终止消化，吹打制成细胞悬液，于1 000 r/min离心5 min，吸净培养基和胰酶混合液，加入完全培养基吹打均匀后，按1∶3比例传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 CCK-8检测细胞增殖 以浓度8×103个细胞/孔接种于96孔板，分为溶剂对照组和不同浓度NC组(1.88 μmol/L、3.75 μmol/L、7.5 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L)，每组设5个复孔，待细胞贴壁后，按照实验分组分别给药24 h、48 h。取出96孔板，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱继续孵育1 h后，在酶标仪上于450 nm波长处测定吸光度(OD)值。

1.4 流式细胞检测细胞凋亡 以浓度4×105个细胞/孔接种于6孔板，分为溶剂对照组和不同浓度NC组(15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L)。待细胞贴壁后，按照实验分组给药48 h，然后以HBSS洗涤细胞，用0.25%胰酶消化液(不含EDTA)消化收集细胞，将各组实验样本用HBSS洗涤细胞2次 (1 000 r/min离心5 min)，收集1×105～5×105个细胞，加入400 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide 混匀，于室温在避光条件下反应5～15 min。1 h内进行流式细胞仪的观察和检测，本实验独立重复3次。

1.5 Western blotting实验 以每孔6×105个细胞接种于6孔板，设溶剂对照组和3个实验组(15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L)。待细胞贴壁后，按照实验分组给药24 h，然后以HBSS洗涤细胞，加入RIPA细胞裂解缓冲液裂解细胞，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液以超微量分光光度计进行蛋白定量。各组分别取等量蛋白以SDS/12%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行电泳分离，电转膜至硝酸纤维膜(0.22 μm)，一抗Cyt-c(1∶1 000)；Caspase-3(1∶1 000)；Tublin(1∶5 000)孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min，在室温下孵育荧光二抗1 h。用红外荧光扫描成像系统进行扫膜。使用Image-Pro-Plus 6.0软件分析测量蛋白条带灰度值，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平，本实验独立重复3次。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NC抑制HT29细胞的增殖 不同浓度NC分别作用于细胞24 h、48 h后，细胞存活率均显著降低(P<0.001)，并呈浓度依赖性趋势，且48 h后的细胞存活率更低(P<0.001)，见图1。其中15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L NC对HT29细胞存活率的抑制作用较明显，因此后续实验采用15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L NC。

2.2 NC诱导HT29细胞凋亡 分别用不同浓度NC(15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L)处理HT29细胞48 h后，各组凋亡率从(3.51±1.16)%分别增加至(35.30±14.30)%、(41.48±17.89)%和(46.51±11.35)%，与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，不同浓度NC组间比较无明显差异(P>0.05)，见图2。

2.3 NC对caspase-3和Cyt-c蛋白表达的影响

不同浓度NC(15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L)分别作用于细胞24 h后，caspase-3和Cyt-c蛋白表达水平均明显升高(均P<0.05)，不同浓度组间比较无明显差异(P>0.05)，见图3、图4。

  

与24 h的对照组相比，*P<0.001；与48 h的对照组相比，#P<0.001。图1 NC抑制HT29细胞的增殖

  

A：代表性Annexin V-FITC/PI流式细胞凋亡检测图；B：3次独立实验的细胞凋亡率；与对照组相比，*P<0.05或**P<0.01。图2 NC对HT29细胞凋亡的作用

  

A：western blotting蛋白条带；B：Cyt-c蛋白相对表达量；与对照组比较，**P<0.01。图3 不同浓度NC对HT29细胞Cyt-c蛋白表达的影响

  

A：western blotting蛋白条带；B：caspase-3蛋白相对表达量；与对照组比较，*P<0.05。图4 不同浓度NC对HT29细胞caspase-3蛋白表达的影响

3 讨 论

由于具有抗炎、抗疟、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性，活性生物碱NC引起了人们的研究兴趣。在抗肿瘤方面，NC能够诱导各种癌细胞发生凋亡。通过抑制ERK信号通路，NC下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达并上调促凋亡蛋白Bax，激活caspase-9、caspase-3和p53等蛋白，从而引起结直肠癌HCT116细胞凋亡[8]。通过引起线粒体膜电位下降，NC诱导胃癌SGC7901细胞发生凋亡[12]。此外，NC被人肺癌A549细胞摄入后选择性富集在细胞线粒体中并引起线粒体去膜电位和细胞凋亡[11]。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用[13]。经典的细胞凋亡途径包括线粒体内部凋亡途径和死亡受体介导的外部凋亡途径。上述研究表明，线粒体凋亡途径参与调控NC诱导的细胞凋亡作用。

数学全息定义的教学一般应强化．这里的强化主要指“三多”和“三化”，“三多”即多花时间、多思考(理解)、多应用，“三化”即正反例强化、逐步内化、螺旋深化．教师可通过设计一些典型的问题情境，让学生经历概念形成、概念理解、概念应用、概念分析的过程，并应组织好生生交流、师生互动等教学活动．非全息定义的教学一般不宜强化，只宜淡化，即不能要求过高，更不能深挖．

随着森林面积的不断增加，保护任务加重，森林资源保护手段欠缺。林业信息化建设薄弱。尤其是森林防火方面，野外火源防不胜防，具有突发性和扑救的艰巨性。除了南北山各绿化区有承包单位进行管护外，近几年营造的重点林业工程权属多为集体，随着林地面积的增加，管护任务日益繁重，乱砍、乱采、乱挖屡禁不止，加剧了地表植被破坏。而我市林业信息化正处于起步阶段，林业资源信息化发展存在劣势。生态建设的信息资源整合力度不大，缺乏统筹管理，开发利用滞后，信息化应用跟不上林业核心业务的需求。

本研究的CCK-8细胞活性检测实验结果表明，与溶剂对照组比较，随着NC浓度增加，NC实验组HT29细胞的存活率逐渐降低，并呈时间依赖性。流式细胞检测结果进一步显示，与溶剂对照组相比，NC诱导HT29细胞发生凋亡并呈浓度依赖性。因此，NC能够抑制人结肠癌HT29细胞增殖并诱导细胞凋亡。Cyt-c具有调节能量代谢和调节细胞凋亡的功能，是线粒体凋亡信号通路的关键调控蛋白之一。线粒体功能障碍导致线粒体膜完整性降低，通透性发生变化，Cyt-c从线粒体膜间隙释放，激活细胞内pro-caspase-9，上调caspase-9的表达，诱发执行细胞凋亡的最终效应蛋白caspase-3的表达，剪切细胞及细胞核内骨架蛋白，介导细胞核片段化，引起细胞形态的变化如出现细胞皱缩、DNA裂解、染色体浓缩和凋亡小体的形成等，最终诱发caspase瀑布式级联放大反应引起细胞凋亡[14-15]。

在改造工程里，我们应当尤其注重路面强度。毕竟在常见的沥青路面上，严重的车辙、裂缝、鼓包等都将严重影响车辆的行驶安全，则极易造成交通事故。而据调查研究，路面稳固性又和路面基层有关，基层和面层问题需要两手同时抓，重点关注一些常见问题。在我们掌握的情况下，可以对路面结构进行有效修补。

因此，为了进一步探讨线粒体凋亡途径在NC诱导的HT29细胞凋亡中的作用，本组借助western blotting手段检测NC作用后HT29细胞中Cyt-c及其下游caspase-3蛋白的表达水平。结果表明，与溶剂对照组相比，各NC实验组的Cyt-c和caspase-3蛋白的表达均显著上调，提示NC可能通过Cyt-c介导的细胞凋亡途径诱导HT29细胞凋亡，属于caspases蛋白依赖方式。

综上所述，NC能够诱导人结肠癌HT29细胞发生凋亡并呈剂量和时间依赖性，其分子机制可能与Cyt-c/caspase-3信号级联反应介导的线粒体内部凋亡途径有关。

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