据统计，全球每年有超过30万的新生儿患有严重的遗传性血红蛋白病，其中镰状细胞性疾病(sickle cell disease，SCD)和β地中海贫血(β-thalassemia，β地贫)是人类最常见的β类血红蛋白病，主要流行于发展中国家[1]，其中β地贫在我国广西、广东、海南、云南等地区发病率较高。β地贫是由于β珠蛋白基因突变或缺失导致β-肽链合成不足或缺如，α/β链不平衡，过剩的α链沉积于红细胞中形成α链包涵体附着于红细胞膜上，使红细胞寿命缩短和破坏增多，导致“无效造血”，表现为慢性溶血性贫血、髓外造血和铁过载进而引起骨骼改变和心血管系统、消化系统、内分泌系统等组织器官功能障碍[2-3]。

多媒体对于提升教学效果有着重要的作用，多媒体运用到小学数学教学中，可以促进学生学习质量的提高，促进老师教学质量和教学效果的提升，因此，我们对多媒体的运用提出若干意见和建议，从而促进了小学数学教学效果的提升。

目前对于β地贫的治疗主要包括输血、铁螯合剂、脾切除、造血干细胞移植、药物诱导胎儿血红蛋白合成以及基因治疗等，其中造血干细胞移植是唯一能够根治β地贫的方法，但由于费用昂贵、移植风险以及配型困难等问题使干细胞移植治疗很难在发展中国家普及[4]。迄今，针对β珠蛋白合成不足的治疗主要集中在正常β珠蛋白基因的导入和内源性γ珠蛋白基因的再次诱导激活两个方面，而药物诱导γ珠蛋白合成仍然是当今研究领域中的热门方向，其中代表药物主要为羟基脲，其作用机制可能是细胞毒作用影响红细胞成熟分化，间接在细胞水平上增加胎儿血红蛋白的含量[5]。研究表明，长期使用羟基脲治疗能有效改善部分β地贫患者贫血症状，提高外周血Hb及Hb F含量，减少输血频率[6]。近年来，microRNA(miR)成为了生物学研究的重点，越来越多的研究显示miR在正常血红蛋白合成和β地贫的发病过程中起重要作用[7]。本文以K562细胞为研究对象，旨在了解羟基脲对K562细胞γ珠蛋白基因的表达作用及可能涉及的miR基因调控，以探讨药物治疗β地贫的新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI1640培养基购自于GIBCO(批号：C11875500BT)；FBS南美洲胎牛血清购自于GEMINI(批号：900-108)；青—链霉素混合液购于Solarbio公司(批号：20170413)；羟基脲购于Sigma公司(批号：MKBR1926V)：用PBS溶解，配成100 mmol/L的储存液，置于-20 ℃冰箱中保存备用。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司(批号：AK4601)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)购自Roche公司(批号：19317900)；AII-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit购自GeneCopoeiaTM(批号：613WI1001);TrizoL试剂购自Biotopped公司(批号：170920)。γ-globin gene和GAPDH引物由英潍捷基(Invitrogen,上海)公司合成，miR引物由GeneCopoeiaTM公司合成并验证，引物序列见表1。

 

表1 引物序列

  

引物序列(5’⁃3’)γglobingeneF：GGCAAGGTGAATGTGGAAR：ATGATGGCAGAGGCAGAGDAPDHF：GTCAGCCGCATCTTCTTTR：CGCCCAATACGACCAAAThsa⁃miR⁃486⁃3pCDDDDCAGCUCAGUACGGAUhsa⁃miR⁃210⁃5pAGCCCCUGCCCACCGCACACUGhsa⁃miR⁃451aAAACCGUUACCAUUACUGAGUUhsa⁃miR⁃26b⁃3pCCUGUUCUCCAUUACUUGGCUChsa⁃miR⁃96⁃3pAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUGhsa⁃miR⁃151a⁃3pCUAGACUGAAGCUCCUUGAGGhsa⁃miR⁃146a⁃3pCCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAGhsa⁃miR⁃503⁃3pGGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGG

1.2 细胞培养及诱导 K562细胞珠购自于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。将对数生长的K562细胞接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养，细胞生长良好，隔天换液并传代一次，实验前12 h 换液，细胞处于对数生长期成活率大于95%。以羟基脲0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的浓度诱导K562细胞24 h、48 h、72 h、96 h后收集细胞。

1.3 RNA提取及cDNA合成 参照 TrizoL试剂说明书分别提取上述各组中各细胞的总RNA，测定浓度和纯度。根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司(批号：AK4601)说明书将1 μg总RNA反转录成用于γ珠蛋白基因荧光定量检测的单链cDNA，并且根据AII-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit购自GeneCopoeiaTM(批号：613WI1001)说明书将1～5 μg总RNA反转录成用于miR 荧光定量检测的单链cDNA，将反应所得的两种cDNA储存于-20 ℃备用。

1.4 qPCR检测γ珠蛋白基因表达 γ-珠蛋白基因检测于CFX96TM Real-Time System (BIO-RAD) PCR仪上进行。反应体系为：20 μL反应体系含FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，加入RNase去酶水致总体积为20 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环，热循环完成后进行64～95 ℃溶解曲线测定，反应结束后电脑自动分析定量结果。所有样品检测均包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果。每个样品中γ珠蛋白基因相对mRNA表达水平用2-△△CT法进行计算。

1.5 qPCR检测miR基因表达 相关miR基因表达的检测于CFX96TM Real-Time System (BIO-RAD) PCR仪上进行。参照AII-in-OneTM miRNA qPCR Detection Kit (公司GeneCopoeiaTM，批号：613WI1001)说明书，20 μL反应体系中加入AII-in-One qPCR Mix(2×)10 μL，AII-in-One miRNA qPCR Primer(2 μmol/L)2 μL，Universal Adaptor PCR Primer(2 μmol/L)2 μL，Firt-stand cDNA(diluted 1∶5) 2 μL，加RNase去酶水致总体积为20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共计40个循环，热循环完成后进行64～95 ℃溶解曲线测定，反应结束后电脑自动分析定量结果。所有样品检测均包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果。每个样品中γ珠蛋白基因相对mRNA表达水平用以下公式计算：相对mRNA表达=2-△△CT。

1.6 统计学方法 采用IBM SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，实验重复3次，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 羟基脲诱导K562细胞后γ珠蛋白基因表达情况 γ珠蛋白基因表达同时受浓度和时间影响，不同浓度(F=352.387，P<0.01)和时间(F=823.875，P<0.01) γ珠蛋白基因表达差异有统计学意义，两者之间存在交互作用(F=303.642，P<0.01)。300 μmol/L浓度羟基脲对γ珠蛋白基因表达促进作用最强，400 μmol/L浓度次之，200 μmol/L和100 μmol/L浓度促进作用较弱；不同作用时间对γ珠蛋白基因表达亦有影响，其中300 μmol/L浓度作用72 h表达最显著，而400 μmol/L浓度作用96 h表达最明显，见表2。

 

表2 不同时间、不同浓度诱导K562细胞后γ珠蛋白基因表达情况

  

不同浓度组/μmol/L24h48h72h96h01 001 001 001 001001 18±0 091 96±0 13∗△#2 43±0 15∗#1 28±0 10∗△2001 19±0 06∗#2 36±0 13∗△#3 13±0 11∗△#1 82±0 04∗△#3001 24±0 06∗#2 65±0 01∗△#4 87±0 14∗△#2 45±0 06∗△#4001 08±0 13#1 75±0 16∗△#2 38±0 14∗#4 62±0 16∗△#

与0 μmol/L组比较，*P<0.05；相同时间不同浓度之间两两比较，△P<0.05；相同浓度不同时间之间两两比较，#P<0.05。

2.2 羟基脲诱导K562细胞后相关miR基因表达情况 羟基脲300 μmol/L诱导K562细胞72 h后，检测相关miR基因表达情况，与0 μmol/L组相比，300 μmol/L羟基脲组hsa-miR-451a(t=-25.131，P<0.01)和hsa-miR-503-3p(t=-39.653，P<0.01)表达明显增多，分别是0 μmol/L组的2.32和2.42倍；hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-151a-3p和hsa-miR-210-5p表达与0 μmol/L组相比明显下降，分别是0 μmol/L组的0.79、0.72和0.65倍(t=3.832，P<0.05；t=39.448，P<0.01；t=26.779，P<0.01)；而hsa-miR-96-3p、hsa-miR-486-3p和hsa-miR-146a-3p表达与0 μmol/L组比较无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

  

与0 μmol/L组比较，*P<0.05或**P<0.01。图1 qPCR检测相关miR基因相对表达水平

2 讨 论

MiR是一类大小约22个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA，最早于1993年在线形虫中发现，普遍存在于真核生物、原核生物等各种生物体内。目前已发现的miR超过两千种，能够调控超过30%的真核生物基因表达，参与细胞染色质重塑、增殖、分化和凋亡等过程，并参与免疫反应和多种疾病[8-9]。有关研究表明miR参与了红系分化过程的不同阶段，随着造血干细胞的不断分化，在白细胞、红细胞、血小板的分化成熟各个阶段中均能检测到特异性miR的动态变化表达[10-11]。miR-144/145是目前发现的在成熟红细胞中表达最多的miR，能够特异性抑制RAB14蛋白表达，促进红细胞β珠蛋白基因表达[12]，而miR-96则直接抑制红细胞γ珠蛋白基因表达，进而抑制正常红细胞的生成[13]。其他还有miR-142[14]、miR-150[15]和miR-221、miR-222[16]、miR-30a[17]等亦在红细胞的分化和成熟过程中起到促进和抑制作用。近年来，研究不断发现miR在β地贫的发生发展过程中起重要作用，相关miR表达的升高或降低能够促进γ珠蛋白基因表达，增加胎儿血红蛋白合成，改善部分β地贫患者贫血症状。研究表明miR-486-3p能够直接抑制BCL11A转录因子的表达进而促进人红系细胞γ珠蛋白的表达，改善β地贫患者贫血症状[18]，而BCL11A是γ珠蛋白向β珠蛋白转换的关键调控因子，下调BCL11A基因表达能明显促进Hb F的表达水平[19]。有学者发现，miR-210与地中海贫血关系密切，在缺氧环境下其表达显著升高[20]，地贫患者因慢性溶血和贫血导致体内氧含量长期不足，Siwaponanan等[21]发现，β地贫/Hb E患者外周血中血浆和红细胞的miR-210表达量与健康对照组比较显著增高。此外，研究者还发现miR-210能够促进红系分化过程中γ珠蛋白基因的表达，而这一作用可能是通过作用于BCL11A转录因子来实现[22-23]。Roy等[24]将β地贫患者外周血分离得到的CD34+进行体外培养，发现miR-503的表达量显著下调，并且miR-503的表达情况与地贫患者疾病的严重程度相关，表明上调该miR能改善β地贫患者的临床症状。Pase等[25]通过研究斑马鱼发现miR-451在红系成熟过程中起着重要作用，Svasti等[26]在地贫患者早期红系祖细胞中发现miR-451呈双向高表达，但其对地贫的具体调节作用及作用机制尚不清楚。此外，还有miR-26b、miR-15Aa/-16-1、Lin28b等均能上调γ珠蛋白基因表达，而miR-146a、miR-96、Let-7则抑制γ珠蛋白基因表达[27]。

羟基脲是第一个通过FAD批准用于治疗SCD的药物[28]，由于β地贫与SCD在发病机制上存在相似性，因此人们也将羟基脲广泛用于β地贫的治疗，其主要作用是诱导γ珠蛋白基因表达增加胎儿血红蛋白合成[29-30]。大量临床研究表明，羟基脲能有效改善β地贫患者贫血症状，减少输血频率和减少疾病相关并发症的产生[6, 31-33]，但这也仅限于部分地贫患者，其在重型和中间型偏重的β地贫患者中疗效较差，且因长期使用效率下降以及对组织器官潜在的毒性反应等问题，限制了该药的临床使用[34-36]。尽管羟基脲对SCD和部分β地贫患者疗效确切，但其诱导Hb F产生的具体作用机制尚未完全阐明。近年来，随着miR研究领域的发展，有学者发现羟基脲在诱导γ珠蛋白基因表达上调过程中miR参与了其中的调节。Walker等[37]对羟基脲治疗的SCD贫血患者和健康志愿者的外周血有核细胞进行检测，发现SCD贫血患者miR-26b和miR-151表达量明显增高，并且miR-151高表达与羟基脲诱导Hb F合成直接相关。随后Alijani等[38]用慢病毒介导miR-26b转染K562细胞，也验证了miR-26b对γ珠蛋白基因的诱导作用。

在荒漠区样方中，将探地雷达所测每条测线的土壤体积含水量进行克里金插值，所得样方内土壤含水量的分布图如图2所示。

本实验中，羟基脲分别以0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L和400 μmol/L的浓度作用于K562细胞24 h、48 h、72 h和96 h，检测γ珠蛋白基因mRNA的相对表达量，以获取羟基脲调控的最佳浓度和作用时间，实验证明，羟基脲能够促进γ珠蛋白基因高表达，表现出一定的浓度依赖性和时间依赖性，其中以300 μmol/L、72 h和400 μmol/L、96 h的诱导作用最为明显(P<0.01)。随后，进一步以300 μmol/L、72 h的条件诱导K562细胞，检测相关miR的相对表达量，结果显示miR-451a和miR-503-3p的表达量明显升高，分别为0 μmol/L组的2.32和2.42倍(均P<0.01)。这与前文所述的上调miR-505的表达量能够改善β地贫患者贫血症状的观点有着异曲同工之处。而目前对于miR-451与β地贫以及γ珠蛋白基因调控之间的关系尚无确切定论，本实验中羟基脲作用后的K562细胞γ珠蛋白基因、miR-503-3p和miR-451a表达量均明显上调，表明羟基脲可能通过诱导miR-503-3p和miR-451a上调来调控γ珠蛋白基因高表达。miR-96通过作用于γ珠蛋白基因mRNA的CDS区域来抑制γ珠蛋白基因表达，为γ珠蛋白生成抑制因子[13]。同样，miR-146a亦为γ珠蛋白生成抑制因子[27]。相反，miR-486-3p则通过直接抑制BCL11A转录因子来促进γ珠蛋白基因表达，为γ珠蛋白生成促进因子[18]，而本实验中测得羟基脲组miR-96-3p、miR-146a-3p、miR-486-3p表达量较0 μmol/L组均无明显变化，表明羟基脲在促进γ珠蛋白基因表达过程中，可能这3个miR不参其中调控。此外，实验中还测得miR-26-3p、miR-151a-3p、miR-210-5p在羟基脲组中表达量均较0 μmol/L组减低，这与Walker等[37]和Alijani等[38]的研究结果以及与miR-210促进γ珠蛋白基因表达的结论[22]正好相反，这可能与研究所用的细胞类型以及检测的miR成熟体不同有关。许多miR前体均会产生两条有功能的成熟miR，分别缀以3p或5p，并靶向不同的位点，本实验检测的miR 除miR-451a外，其他均有3p和5p之分，而实验中只检测了其中一种成熟体，这可能是导致本实验中某些结果与其他研究的结果不一致的原因。

综上所述，目前大量的实验研究均证实羟基脲有诱导γ珠蛋白基因高表达作用，其具体作用机制目前尚未完全阐明，而miR在β地贫Hb F合成以及羟基脲诱导γ珠蛋白基因表达过程中所扮演的角色正逐步被人们揭示，本研究结果可能会给β地贫的治疗带来新的靶点，为药物治疗β地贫提供新的思路。

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