TREM2受体是DAP12相关受体膜蛋白，广泛表达于中枢单核细胞吞噬系统表面[1]，尤其是小胶质细胞。在脑内TREM2受体只表达在小胶质细胞上，这些细胞参与抗原、细胞以及异物识别和吞噬过程，同时还参与中枢神经炎症反应的过程。已有研究[2]证实，TREM2是中枢神经系统小胶质细胞上表达的特异性基因。鼠的TREM2基因位于17号染色体C3区，5个外显子共同编码一个跨膜糖蛋白受体，其结构由细胞膜外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域构成。TREM2-DAP12轴参与完成其他下游信号通路[3-4]，受到越来越多的关注。有研究[5-6]认为，TREM2基因具有抑制中枢炎症及介导加强中枢单核细胞吞噬系统对Aβ、凋亡细胞碎片等吞噬功能。如果能有效提高细胞中TREM2表达，就能有效地提高细胞对Aβ、凋亡细胞碎片的吞噬功能和抑制中枢炎症等功能。由此可见，提高TREM2的表达是基础研究的迫切需要。不同于一般的逆转录病毒载体，慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的载体，在基因转移中有着非常广阔的应用前景。因此，本实验选用慢病毒载体系统构建TREM2过表达载体。本研究中所用慢病毒载体为GV358载体，该载体含2个启动子SV40和IRES，且这2个启动子后分别紧接EGFP和puromycin，使该慢病毒载体感染目的细胞后，EGFP和puromycin能更高效地表达，有助于后续观察感染效率和用嘌呤霉素筛选细胞。本研究构建过表达TREM2的慢病毒载体，并感染293T细胞，对其进行鉴定，从而有助于深入研究TREM2在抑制中枢炎症和介导吞噬中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

1 kb DNA梯状标志购于Fermentas公司；GV358载体、AgeI/AgeI酶切、293T细胞、大肠埃希菌菌株DH5α、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；胎牛血清、细胞培养基(DMEM)购于Gibco公司；Plasmid抽提试剂盒购自Promega公司；In-FusionTM PCR克隆试剂盒购于美国clontech公司；限制性内切酶购自NEB公司；Primer、250 bp DNA ladder Marker购于捷瑞生物公司；脱氧核苷三磷酸(dNTP)购于Takara公司；Taq聚合酶购于SinoBio公司；琼脂糖购于赛百盛公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化公司；胰酶购于上海生工生物工程股份有限公司。高速离心机(日立公司)；positive clone测序(上海美季生物技术有限公司)；PCR仪(Applied Biosystems公司)；细菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；细菌摇床(华利达实验设备公司)；凝胶成像仪(天能公司)；稳压DNA电泳仪(BioRad公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计合成与TREM2基因片段的获取 从GenBank资料库中获得小鼠TREM2的mRNA序列(NM-001106884)，设计基因引物：TREM2(14272-1)-P1:5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGACCTCTCCACCAG-3’；TREM2(14272-1)-P2:5’-TCCTTGTAGTCCATACCCGTACCTCCGGGTCCAGTG-3’(引物说明：含酶切位点、交换配对碱基，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因)，引物的设计和合成由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。配制如下反应体系：上游引物和下游引物各1 μL，ddH2O 32.5 μL，5×Buffer 10 μL，dNTP Mix 4 μL，模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA polymerase 0.5 μL，混匀，短暂离心，98 ℃ 5 min，然后98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 90 s，共30次循环，72 ℃ 8 min 后取出置于4 ℃冰箱，TREM2基因片段的扩增完成。

1.2.2 TREM2-GV358质粒的构建 取ddH2O 42 μL，10×Cut Smart Buffer 5 μL，纯化的GV358质粒(1 μg/μL)2 μL，AgeⅠ(10 U/μL)1 μL，将上述试剂混匀，短暂离心，置于37 ℃水浴反应3 h，得到线性化的GV358载体。分为GAPDH组、自连对照组和TREM2组3组。于冰水浴中配制如下反应体系：ddH2O(2.5 μL、4.5 μL、3.5 μL)，5×CE Ⅱ Buffer(每组各2 μL)，线性化GV358载体DNA(每组各2.5 μL)，纯化后的TREM2基因片段(2 μL、0 μL、1 μL)，ExnaseTM Ⅱ(每组各1 μL)。混匀，短暂离心，于37 ℃反应30 min，然后置于冰水浴中冷却5 min。将上述产物转化大肠埃希菌菌株DH5α，取适量菌液接种至含相应抗生素的LB固体培养基平板上，孵育过夜。

1.2.3 TREM2-GV358质粒的PCR鉴定 在LB固体培养基平板上挑取8个菌落做PCR鉴定，并且设空白对照组(ddH2O)、阴性对照组(空载自连)和阳性对照组(GAPDH)，引物为Ubi-F(5’-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3’)；FLAG-R-2(5’-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3’)。配制如下反应体系，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，ddH2O 9.2 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，振荡混匀，短暂离心，向20 μL鉴定体系中加入用无菌枪头挑取的单个菌落，混匀，置于PCR仪中，94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共22次循环，72 ℃ 5 min后取出置于4 ℃冰箱。将鉴定出的阳性克隆转化子接种培养16 h，挑取适量菌液送上海美季生物技术有限公司测序。

1.2.4 慢病毒载体的包装与滴度检测 转染前1 d，将生长状态良好的293T细胞接种于10 cm细胞培养皿中，待细胞密度达70%～80%时，将慢病毒表达质粒(TREM2-GV358 20μg)、包装质粒(pHelper 1.0载体质粒15 μg、pHelper 2.0载体质粒10 μg)与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀后共转染293T细胞，置于37 ℃、5% CO2环境中培养；转染后6 h换成20 mL含10%血清的细胞培养基，继续培养48 h后收集细胞上清。于4 ℃，4 000 r/min离心10 min；将上清液过滤于40 mL超速离心管中，4 ℃ 25 000 r/min离心2 h，收集病毒浓缩液于-80 ℃冰箱保存。以药筛法测定病毒滴度，操作步骤为(1)测定前1 d以每孔4×104个293T细胞接种于96孔培养板中，每孔加入培养基100 μL；(2)将病毒原液用培养基以10倍梯度逐孔稀释为100～10-56个浓度的病毒液，用各浓度的病毒液感染293T细胞，置于37 ℃、5% CO2环境中培养；(3)24 h后，更换100 μL完全培养基，继续培养，72 h后加入抗性药物嘌呤霉素，维持药物浓度3 μg/mL。继续培养1 d，观察活细胞的数量，活细胞数随病毒原液稀释倍数的增加而减少，病毒滴度=活细胞数/病毒原液量。

1.2.5 实时定量PCR检测慢病毒感染后293T细胞内TREM2的表达情况 将293T细胞接种于24孔板(5×104个/孔)，待培养细胞融合度达到30%时，重组病毒GV358-TREM2感染细胞。分为两组，OE组：慢病毒GV358-TREM2感染293T细胞组；CON组：293T细胞样品。感染时使用无血清培养基，12 h后更换10%胎牛血清培养基，待GFP荧光数量表达稳定后收集细胞。采用实时定量PCR的方法检测TREM2基因的表达情况，采用2-△△Ct方法计算TREM2相对表达量。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差)表示，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR扩增TREM2基因片段及重组质粒TREM2-GV358的鉴定

目的基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，显示有一明亮特异性扩增条带在725 bp处，片段大小与预期一致，表明目的基因扩增成功(图1)。将重组质粒TREM2-GV358进行PCR鉴定，可见876 bp处明亮的单一条带，即阳性克隆，载体大小与预期相符(图2)。

利用无人机进行工程测量时，需要考虑在山地、矿区和丛林等特殊的环境条件下使用的效果。在工程测量范围内，应对无人机进行合理的升降设置，设置滑翔距离，使其能够顺利完成起飞。对于大型无人机而言，当不能满足其起飞的条件时，需结合自然环境适当调节起飞的高度，提高对风力的抵抗能力，并有效防止因山间大风的干扰造成无人机坠毁。另外，运用无人机测绘技术还需考虑无人机重量、机械设备的外形等会影响起飞状态的因素，再结合实际情况调整无人机机械设备的参数，以便提高操作过程中的安全性，并满足工程测绘过程中的测量需求。

  

 

图1 TREM2基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

  

1：空白对照组(ddH2O)；2：阴性对照组(空载自连)；3：阳性对照组(GAPDH)；4：Marker；5～12：TREM2 1-8号转化子。图2 TREM2-GV358重组质粒的PCR鉴定

2.2 阳性克隆测序结果

最近研究[7]发现，晚发型阿尔茨海默病(LOAD)另一个风险系数与ApoEε4相似的危险因素—TREM2基因的变异体。有研究[8-9]表明，TREM2突变会增加近3倍罹患AD的风险。前期研究[10]也发现了TREM2基因在AD患者及AD动物模型中具有丰富的表达，而且在动物模型中发现Aβ区域分布及Aβ含量与TREM2基因表达呈正相关[9，11]。中枢神经系统炎症是LOAD发生及发病进程中的重要因素[12]。目前大量证据表明，拥有相似的神经炎症发病机制的神经退行性疾病有帕金森症(PD)、AD、额颞叶痴呆症(FTD)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。已有研究[9，13-15]报道，TREM2突变与PD、FTD和ALS的发病有关。研究认为TREM2基因具有加强对Aβ吞噬与代谢并抑制中枢炎症反应的功能。然而，目前对其确切的作用机制却不甚明了。TREM2高度富集于小胶质细胞，TREM2在调节小胶质细胞炎症反应中的作用也在细胞实验中被证实[16]。因此，TREM2可作为治疗AD的一个潜在靶点。如果能有效地提高小胶质细胞中TREM2表达，就有可能为这些中枢神经退行性疾病的预防和治疗带来新的希望与契机。本研究构建了过表达TREM2基因的慢病毒载体，并进行体外感染293T细胞及鉴定，为有关TREM2的实验研究奠定了基础。

2.3 慢病毒滴度测定

甘肃位于中国地理中心，地理位置N 32°11′～42°57′，E 92°13′～108°46′，地形狭长，横跨多个气候带，地貌错综复杂，山地、高原、平川、河谷、沙漠、戈壁等多种地貌类型并存，是全国各省区中地质地貌和气候类型最为丰富复杂的省份。

构建好的TREM2过表达慢病毒滴度为2.0×108 TU/mL，达到下一步实验对病毒滴度的要求。

2.4 慢病毒感染后293T细胞TREM2 mRNA的表达情况

2.4.1 感染后细胞荧光观察 慢病毒感染72 h后，荧光倒置显微镜下可观察到大量带有明显荧光的细胞，见图3。

  

A：×100；B：×200。图3 慢病毒感染293T细胞后荧光显微镜下荧光表达情况

2.4.2 实时定量PCR检测慢病毒感染后293T细胞TREM2的表达情况 以Actin为内参，计算两组2-△△ct值。CON组为(1.042±0.690)，OE组为(1 154.92±0.070)。与CON组相比，OE组TREM2相对表达量显著升高(P<0.001)。

3 讨 论

将PCR鉴定成功的阳性转化子TREM2-GV358送上海美季生物技术有限公司进行DNA测序分析。测序结果与GenBank上的TREM2基因标准序列完全一致，无碱基突变和读码框移，表明已正确构建TREM2-GV358重组质粒。

伴随分子生物学技术的不断发展，各种可以改变基因表达水平的方法和手段日趋进步。目前，慢病毒载体导入外源性基因的技术备受学者推崇而成为转染技术的首选方法。与普通质粒应用脂质体导入目的基因的方法相比，利用慢病毒载体导入外源性基因的手段具有携带外源性基因片段容量更大、感染效率更高、表达更稳定[17]及对分裂和非分裂细胞均具有感染能力等优点。与腺病毒相比，慢病毒感染具有长时间、表达稳定的优势，而且感染后不易引起明显的细胞损伤和免疫反应[18-19]。慢病毒载体感染目的细胞后即失去感染能力，也不会在宿主细胞内产生新的病毒颗粒，属于“自杀”性病毒，具有较好的靶向性和安全性[20]。因此，慢病毒载体是非常理想的目的基因转移载体[21]，广泛应用在以基因为靶点的各种基础实验研究中[22]。

本实验成功构建并包装了重组TREM2-GV358慢病毒载体，用成功包装的慢病毒体外感染293T细胞，采用RT-PCR在mRNA水平检测到TREM2表达明显增加，说明TREM2-GV358能够有效介导TREM2的过表达，为进一步研究TREM2在AD等中枢神经退行性疾病发病机制中的作用打下了良好的实验基础。

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