淫羊藿多糖是中药淫羊藿的主要成分。研究发现，淫羊藿多糖对鸡具有免疫调节作用，并作为免疫佐剂使用[1]。中药淫羊藿具有温补肾阳、纳气平喘的功效，临床上辨证运用治疗慢性支气管炎的疗效良好[2-3]。现代药理研究也发现淫羊藿具有调节免疫、抗炎等作用[4]。但淫羊藿多糖作为淫羊藿的有效成分之一，其对肺部免疫功能的影响目前尚未见相关报道。因此，本研究通过观察气管肺泡灌洗液中分泌型IgA(sIgA)、肺表面活性物质相关蛋白(SP-A)含量及肺组织β-防御素-2(rBD-2)表达等，探讨淫羊藿多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 54只雄性SPF级SD大鼠，体重(250±20)g，均由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(桂)2014-0002，随机分成正常组(A组)、模型组(B组)、淫羊藿多糖组(C组)，每组18只。B组和C组均复制气管切开插管大鼠模型，A组不做处理。动物饲养环境温度为(20±2)℃，自由进水，普通饲料喂养。

1.2 气管切开插管大鼠模型的制备 采用一次性硬膜外麻醉导管制作气管切开插管留置大鼠模型[5]。大鼠称重，麻醉后，暴露气管，作一切口，将导管送入气管中，缝合消毒。气管外预留导管，固定。

1.3 给药方法 用温水稀释成含药量浓度为0.1 g/mL 50%淫羊藿多糖水溶液。淫羊藿剂量依据人常用剂量每日20 g/人[6]。不同产地淫羊藿多糖含量为22.47%～31.11%[7]，本组采用50%淫羊藿多糖(上海源叶生物科技有限公司，批号：C22A6Y2480)，推算得出本研究淫羊藿多糖人平均常用剂量每日10.4 g/人。根据药理学剂量换算动物剂量折算方法[8]计算，按大鼠(200 g)与成人(70 kg)的体表面积比1∶56，依实验动物与人体表面积等效量换算，即0.2 g/200 g，动物模型制作成功后6 h进行药物干预。C组灌胃给予淫羊藿多糖水溶液，1次/d，A组、B组给予等量生理盐水灌胃，剂量为1 mL/100 g，1次/d。

1.4 取材 分别于造模后24 h、72 h、168 h，每组各取6只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 mL/100 g)，经腹主动脉采血3 mL，置于普通干燥管中，用于测定血清白介素-2(IL-2)水平。取材时结扎右肺，于左肺取肺泡灌洗液，用5 mL冰冻灭菌生理盐水灌洗，反复灌洗3次，回收约3 mL；上述过程重复3次，共回收9 mL；在4 ℃条件下以2 400 r/min离心10 min，取上清，置于-20 ℃冰箱中保存。开胸，取右肺中叶组织100 mg，分装，迅速置于液氮中，后转移至-80 ℃冰箱中保存，用于测定肺组织rBD-2 mRNA表达。

1.5 IL-22、SP-A、sIgA指标测定 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清IL-2水平及肺泡灌洗液中SP-A、sIgA的含量，ELISA试剂盒均购自武汉优尔生商贸有限公司。检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测rBD-2 mRNA表达 取肺组织标本，在液氮中充分研磨成粉末状后，加入组织总RNA提取试剂RNAiso PLUS(日本Takara公司)，逆转录成cDNA，在qPCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司，7500 Fast)上进行PCR扩增反应，PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸5 s，共40个循环；添加熔解曲线：60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：rBD-2上游：5’-AGGCACCAGGCTTCAGTCA-3’，下游：5’-ATACGCCTCCTTTGGTCAGG-3’；GAPDH上游：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。采用2-△△Ct法计算rBD-2 mRNA相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠肺组织rBD-2 mRNA表达水平比较

A组大鼠各时间点rBD-2 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较，B组大鼠造模后24 h rBD-2 mRNA相对表达量明显升高，随后逐渐下降(P<0.05)；与B组比较，C组大鼠造模后24 h rBD-2 mRNA相对表达量显著降低，在72 h、168 h时升高，且72 h时升高最为明显(P<0.05)，见表1。

2.2 3组大鼠肺泡灌洗液sIgA的含量比较 A组大鼠各时间点sIgA含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较，B组sIgA含量在造模后24 h、72 h明显升高(P<0.05)，随后逐渐下降，至168 h回落至正常水平(P>0.05)；与B组比较，C组大鼠sIgA含量在造模后24 h、168 h明显升高(P<0.05)，但随着用药时间的延长升高幅度有所降低，见表2。

2.3 3组大鼠肺泡灌洗液SP-A的含量比较 A组大鼠各时间点SP-A含量比较无明显差异(P>0.05)。与A组比较，B组大鼠各时间点肺泡灌洗液SP-A含量均明显升高，随着插管留置时间的延长，升高幅度逐渐下降(P<0.05)；C组大鼠造模后24 h SP-A含量明显低于B组，但72 h、168 h时明显高于B组(P<0.05)，见表3。

2.4 3组大鼠血清IL-2的含量比较 A组大鼠各时间点IL-2的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较，B组大鼠血清IL-2含量在造模后24 h显著升高(P<0.05)，但随后逐渐降低，72 h、168 h时两组无明显差异(P>0.05)；B组和C组造模后24 h时血清IL-2含量无明显差异(P>0.05)，C组72 h、168 h时IL-2含量较B组明显升高(P<0.05)，见表4。

 

表1 3组大鼠肺组织rBD-2 mRNA表达水平比较

  

组别n24h72h168hA组61 25±0 291 06±0 161 07±0 12B组62 68±0 53∗0 50±0 13∗△0 20±0 11∗△▲C组62 12±0 32∗#4 50±0 70∗#△2 30±1 09∗#▲

与A组同一时点比较，*P<0.05；与B组同一时点比较，#P<0.05；与本组24 h时比较，△P<0.05；与本组72 h时比较，▲P<0.05。

 

表2 3组大鼠肺泡灌洗液sIgA含量比较

  

组别n24h72h168hA组61 51±0 161 38±0 151 67±0 45B组62 09±0 36∗2 36±0 32∗1 51±0 86△▲C组62 83±0 41∗#2 55±0 57∗2 44±0 45∗#

与A组同一时点比较，*P<0.05；与B组同一时点比较，#P<0.05；与本组24 h时比较，△P<0.05；与本组72 h时比较，▲P<0.05。

 

表3 3组大鼠肺泡灌洗液SP-A含量比较

  

组别n24h72h168hA组640．79±6．3943．29±4．8541．65±4．50B组6697．52±70．25∗372．82±146．83∗△133．72±49．27∗△▲C组6540．83±84．96∗#452．58±82．82∗316．78±182．37∗#△▲

与A组同一时点比较，*P<0.05；与B组同一时点比较，#P<0.05；与本组24 h时比较，△P<0.05；与本组72 h时比较，▲P<0.05。

 

表4 3组大鼠血清IL-2含量比较

  

组别n24h72h168hA组619 02±2 4117 97±1 9317 98±2 19B组632 72±12 13∗28 54±9 1725 80±7 76C组635 45±10 5755 12±16 39#△51 42±15 02#

与A组同一时点比较，*P<0.05；与B组同一时点比较，#P<0.05；与本组24 h时比较，△P<0.05。

3 讨 论

气管切开插管建立人工气道改善通气障碍，是抢救急危重症患者的重要措施之一。但气管切开后极易引起肺部感染[9]。感染一旦发生，严重影响疾病的转归和预后。近年来，有学者认为气管切开后并发肺部感染的机制与肺部免疫功能下降有关[10-11]。rBD-2是呼吸道等黏膜上皮细胞分泌的天然防御成分，其合成有赖于感染与炎症刺激[12-13]；sIgA是构成人体呼吸道黏膜屏障的重要组成部分；SP-A是肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的一种重要蛋白复合物，具有调节局部免疫和炎症反应的功能，是判断患者肺损伤程度和预后的指标[14]；IL-2是目前研究较多的用于黏膜免疫佐剂的细胞因子之一，这些物质均在呼吸系统免疫炎症反应中发挥着重要作用，与肺免疫功能密切相关。研究发现，气管切开插管留置大鼠肺组织出现炎症、出血、水肿等一系列病理损伤变化，同时肺部免疫功能发生改变[15]。这种变化与临床气管切开患者并发肺部感染在时间上高度吻合[16]。

本研究发现，气管切开插管留置大鼠IL-2和sIgA分泌增加，而rBD-2和SP-A的表达早期升高明显，随着插管时间的延长逐渐下降。其机制可能是气管插管早期，肺局部损伤，炎症刺激rBD-2和SP-A表达，随着插管留置时间延长，机体负反馈调节，其表达逐渐减少，并刺激IL-2及sIgA分泌增加，提高机体防御反应。淫羊藿多糖可以对抗气管切开插管大鼠早期rBD-2和SP-A的升高，减轻机体的炎症反应；但随着用药时间的延长，淫羊藿多糖又表现出上调作用，提高大鼠肺局部rBD-2 mRNA表达及SP-A、sIgA的含量，增强机体免疫防御能力。本研究还发现，淫羊藿多糖早期干预对外周血IL-2的调节作用不明显，但随着用药时间延长，IL-2水平明显升高。提示淫羊藿多糖能够双向调节气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。这种免疫调节作用可能早期以肺局部为主，但随着用药时间的延长，对局部和全身免疫均有作用。淫羊藿多糖调节肺部免疫的机制，一方面可能是通过促进机体分泌黏膜免疫佐剂IL-2，发挥免疫协同作用。王鲁男等[17]研究发现，淫羊藿多糖可以促进人体CD3的表达和IL-2的产生。尚川川等[18]研究也发现淫羊藿多糖可增强疫苗的免疫效果，促进外周血淋巴细胞转化，提高血清抗体效价。另一方面，rBD-2、sIgA和SP-A的产生和合成，取决于呼吸道黏膜上皮细胞功能，由此推测淫羊藿多糖调节肺部免疫功能，亦可能是间接通过改善呼吸道黏膜上皮细胞功能发挥作用。

(3)加强政策引导与激励措施。管理层面需要全面考虑尾矿整体利用的经济效益和生态效益，充分考虑尾矿减量化、资源化和无害化处置带来的生态环境效益，出台固体废弃物减量化鼓励政策和措施；同时加强推广尾矿综合利用先进技术，建立尾矿整体消纳利用激励约束制度，引导企业加强资源的综合利用，提高尾矿资源化与减量化水平，推进矿业固体废弃物源头减量与循环利用。

综上所述，淫羊藿多糖可以通过调节气管切开插管留置大鼠肺组织rBD-2 mRNA表达，提高肺泡灌洗液sIgA、SP-A含量及外周血IL-2水平，从而改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能，但具体机制仍需进一步研究。

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