肿瘤光动力学治疗(photodynamic therapy，PDT)是近年来新兴的一种行之有效且具有发展前景的肿瘤治疗方法，主要通过光敏物质在一定波长的光作用下被激活，与肿瘤组织中的氧分子作用产生活性较强的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，以此来杀伤肿瘤细胞，达到破坏肿瘤组织的目的[1]。光敏剂作为PDT能够成功实施的重要因素之一，被广泛关注和研究。但许多常用的传统的光敏剂存在ROS产率低、靶向性较差等问题，限制了PDT在临床上的使用[2-3]。因此，研发新型ROS高产且敏感的光敏剂是突破PDT瓶颈的目标。本课题组前期合成一种新型的铜胺纳米材料(copper-cysteamine nanoparticles，Cu-Cy-Nanos)，其不同于传统光敏剂，被激发后可以持续地自发光，与组织中的氧分子反应，不断产生活性氧[4]。本研究旨在对比Cu-Cy-Nanos作为PDT的光敏剂抑制人类不同癌细胞的增殖情况，以期为后续的实验研究及临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 P-亚硝基四甲苯胺(RNO)、咪唑(Imidazole，ID)(美国Sigma公司)；DMEM和青霉素—链霉素(PS)(HyClong，USA)；胎牛血清(FBS)(Gibco，USA)；四甲基偶氮唑(MTT)、二甲基亚枫(DMSO)(中国Solarbio)；96孔细胞培养板(Corning，USA)。

1.2 细胞株与培养 人类肝癌细胞株HepG2、乳腺癌细胞株MCF-7和前列腺癌细胞株Du145均购自中国科学院上海细胞研究所，在本实验室液氮冻存。使用前复苏(37 ℃水浴溶解，3 000 r/min离心3 min，加入完全培养基重悬，接种于培养瓶)，并常规培养于10%FBS和0.1 mL PS的DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中进行培养。

1.3 Cu-Cy-Nanos的合成及表征 将CuCl2•2H2O(0.460 g)和半胱胺(0.636 g)溶解在去离子水(DI)中，然后用NaOH溶液(2.5 mol/L)调节pH，使pH=8。室温下搅拌约2 h，加热至沸腾并持续解热30 min。离心后，用DI和乙醇溶液(v/v=5∶4)对粗产物洗涤5次，进行充分超声处理，得到Cu-Cy-Nanos颗粒。最后，将颗粒放入真空烘箱中，室温下干燥过夜。详见参考文献[4]。

1.4 单线态氧的测量 RNO脱色试验用于证明Cu-Cy-Nanos能够产生单线态氧(singlet qxygen，1O2),RNO的吸光度值与1O2的生成量成反比。将0.225 mg RNO和16.34 mg ID加入30 mL DI中，充分混匀。将1 mg Cu-Cy-Nanos加入3 mL RNO-ID混合溶液中制备样品溶液。采用15W紫外灯在距离RNO-ID溶液和样品溶液3 cm处照射5 min，同时用Shimadzu UV-Vis分光光度计检测RNO吸收强度。

1.5 不同紫外线照射对细胞的影响 用MTT法测定紫外线对细胞的影响。将HepG2细胞接种到96孔板中(约3 000个/孔)，置于培养箱(5% CO2、37 ℃)中培养24 h。 在实验当天，用紫外灯在距离细胞3 cm处用紫外线分别照射0～8 min，继续培养24 h后检测细胞活力。

1.6 Cu-Cy-Nanos对细胞的毒性实验 用MTT法测定紫外线对细胞的影响。将HepG2细胞接种到96孔板中(约3 000个/孔)，在培养箱(5% CO2、37 ℃)培养24 h。在实验当天，去掉旧培养基，加入含有不同浓度Cu-Cy-Nanos的新培养基(0 μg/mL、0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL、200.0 μg/mL)，用紫外灯在距离细胞3 cm处给予5 min的紫外线照射。在细胞培养24 h后评估细胞活力。

1.7 Cu-Cy-Nanos对不同肿瘤细胞生长影响 用MTT实验检测Cu-Cy-Nanos的细胞毒性。将HepG2细胞(3 000个/孔)接种到96孔板中，并使其在培养箱(5% CO2、37℃)中生长24 h。在实验当天，除去旧的培养基。加入100 μL浓度为25 μg/mL的Cu-Cy-Nanos的新鲜培养基。向阴性对照(未与Cu-Cy-Nanos孵育的细胞)中加入PBS溶液。细胞培养24 h后评估细胞毒性。

1.8 统计学方法 本研究所有实验均重复3次。采用SPSS 20.0软件进行数据分析，图表采用GraphPad Prism 5.0进行绘制，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验(Student’s)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Cu-Cy-Nanos的表征 Cu-Cy-Nanos是单晶体且高度结晶，其中大部分为矩形，其范围从几十到几百纳米不等，大多为70～200 nm。Cu-Cy-Nanos的分子量为378.38 g/mol。它的结构中包含两个不同分子价的Cu原子—Cu(1)和Cu(2)(均为Cu+)。Cu-Cy-Nanos表现出强烈的光致发光和X射线发光。Cu-Cy-Nanos的晶体结构和光学性质见文献[4]。

2.2 在不同紫外照射时间下Cu-Cy-Nanos产生1O2的量 采用RNO脱色实验对Cu-Cy-Nanos在不同紫外照射时间下产生进行检测，结果见图1。RNO+Cu-Cy-Nanos组中，随着紫外照射时间的延长，RNO的吸光度值逐渐降低，说明在紫外光的照射下，Cu-Cy-Nanos可以产生1O2，且随着照射时间的增加，产生的1O2含量逐渐增加。在紫外照射4 min后，Cu-Cy-Nanos产生的1O2开始明显增多。

  

图1 Cu-Cy-Nanos在不同紫外光激发下 1O2的产生量

2.3 紫外线对细胞生长的影响 紫外线是用于日常灭菌的方法之一，长时间紫外照射也会对细胞的生长产生一定的影响。本研究采用MTT实验评估不同时间紫外辐射对细胞活性的影响。随着紫外辐射时间的增加，细胞活性逐渐降低。紫外辐射5 min时，对比0 min，细胞活性仍然没有差别；但当紫外辐射时间达6 min后，细胞活性明显下降，差异具有统计学意义(t=4.716，P<0.05)，见图2。结合2.2的实验结果，紫外照射5 min时，Cu-Cy-Nanos能有效地被激活从而产生足量的1O2。因此，在后续实验中，选择5 min的紫外照射作为Cu-Cy-Nanos的激活条件。

  

与0 min比较，*P<0.05。图2 HepG2细胞在不同紫外光照射下的细胞活性

2.4 Cu-Cy-Nanos在紫外照射下对细胞的毒性作用 采用MTT实验检测Cu-Cy-Nanos受到不同的紫外光激发后对细胞的毒性作用，结果显示：在5 min 的紫外光激发下，随着Cu-Cy-Nanos浓度的增加，细胞活性逐渐降低。Cu-Cy-Nanos浓度由0 μg/mL上升至10 μg/mL时，对细胞活性的影响不大，细胞的活性仍然处于94%～100%范围内；当Cu-Cy-Nanos浓度达到25 μg/mL时，细胞活性明显下降(小于90%)(P<0.05)，浓度≥50 μg/mL时，细胞活性下降更为明显(P<0.05)，降至85%以下，见图3。在普通光学显微镜下，对比细胞在0 μg/mL和25 μg/mL时，紫外照射前、后细胞状态，可见加入Cu-Cy-Nanos并经过紫外光的激发后，细胞形状不规则，包体皱缩变小或裂解，细胞数量明显减少，见图4。由于细胞活性在Cu-Cy-Nanos浓度达到25 μg/mL 时开始出现明显降低，因此采用25 μg/mL Cu-Cy-Nanos进行后续实验。

  

与0 μg/mL比较，*P<0.05。

图3 不同浓度Cu-Cy-Nanos受到紫外照射后对HepG2细胞的影响

  

图4 25 μg/mL Cu-Cy-Nanos对HepG2细胞活性影响(×20)

2.5 Cu-Cy-Nanos对不同肿瘤细胞增殖的影响

根据以上的实验结果，以紫外照射时间5 min、Cu-Cy-Nanos浓度25 μg/mL作为实验条件，采用MTT法对比肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7以及前列腺癌细胞Du145这3种癌细胞株对Cu-Cy-Nanos的敏感性。结果显示：随着Cu-Cy-Nanos浓度的增加，3种癌细胞的活性均逐渐降低。MCF-7和Du145细胞活性虽有下降，但在Cu-Cy-Nanos浓度为10 μg/mL前，细胞活性仍保持在85%～90%左右，浓度达25 μg/mL后下降至80%以下，而HepG2细胞活性降低较为明显，Cu-Cy-Nanos浓度为10 μg/mL时细胞活性即降至80%以下，浓度达25 μg/mL时，细胞活性为60%，见图5A。对比Cu-Cy-Nanos浓度在25 μg/mL时，3种癌细胞的活性，可见HepG2细胞活性明显低于MCF-7和Du145细胞(F=23.224，P<0.05)，见图5B。说明Cu-Cy-Nanos受到紫外光激发后，对3种肿瘤细胞的生长均有抑制作用，抑制效果由强至弱依次为：HepG2、Du145、MCF-7。

  

A：3种癌细胞在不同浓度的Cu-Cy-Nanos作用下，细胞活性情况；B：Cu-Cy-Nanos浓度为25 μg/mL时，3种癌细胞的活性比较；与HepG2相比，aP<0.05；与MCF-7相比，bP<0.05；与Du145相比，cP<0.05。图5 Cu-Cy-Nanos对3种癌细胞活性的影响

3 讨 论

PDT是20世纪70年代出现的癌症治疗的一种新型手段，其主要原理是肿瘤细胞吸收具有光敏感性的物质，该物质被特定波长的激发光激发，从基态跃进至激发态，又通过不同的方式回到基态，在这个过程中产生的能量转移至其所在环境中的氧分子(O2)，进而产生了ROS，ROS导致细胞成分的不可逆性损伤[1]。由于PDT具有微创性、不良反应小和靶向性较高等优点[5-8]，受到临床和各研究领域的广泛关注。随着新型光敏剂和激光器不断涌现，PDT技术逐渐成熟，但PDT仍局限于皮肤表面(如皮肤癌)及表浅肿瘤(如食管癌、口腔肿瘤、膀胱肿瘤)的治疗，更深部的癌症(如肝癌)主要还是采用手术切除及药物化疗[9]，其原因在于：(1)光敏剂对肿瘤组织缺乏靶向性，在病灶难以富集；(2)多数光敏剂对可见光源敏感，但可见光在人体组织的穿透能力较差，不能够深入到组织内部；(3)ROS的产量不足，不足以有效充分地杀伤肿瘤细胞[2-3]。

2．3 2007－2011年西城区协助北京市新生儿疾病筛查中心（以下称新筛中心）追访情况 5年中北京市新筛中心仅10%的可疑病例需要区级层面协助追访，其中PKU可疑异常4例，CH可疑异常31例，追访后复诊率分别为83．87%和50．00%。见表2。

江西以中央环保督察问题整改为总抓手，坚持“预防为主、源头控制、综合治理”，着力解决空气、水、土壤等方面群众反映强烈的突出问题，进一步提高环境质量，努力增加人民群众在生态文明建设中的获得感。

传统的光敏剂存在靶向性较差、光选择面窄、ROS产率较低等问题，这些问题大大地限制了PDT在癌症治疗中的应用，因此迫切需要研发靶向性高、ROS产率高的新型的光敏剂，而纳米技术的飞速发展为解决上述难题提供了新的思路。本课题组前期合成了新型Cu-Cy-Nanos[4,10]，该纳米颗粒最突出的两个特点是：(1)Cu-Cy-Nanos通过合适的光(如紫外线、X射线)激活，产生用于癌症治疗的 1O2[4,10]；(2)Cu-Cy-Nanos在被激发后可以连续地自发光，从而不断地产生 1O2[4]。后者解决了传统光敏剂ROS产率低的问题。此外，本课题组在前期试验中证明，可溶性的Cu-Cy-Nanos可以进入细胞分泌的外泌体(Exosomes)(待发表)。外泌体是一种由多种细胞分泌、直径30～150 nm的囊泡样小体，对分泌的母细胞具有极高的亲和性，已被证明是癌症药物输送系统中的天然载体[11-12]。这又为Cu-Cy-Nanos的靶向运输纳米粒子提供了新的途径。

本研究进一步证实了Cu-Cy-Nanos在紫外光的激发下可以产生 1O2，且随着紫外照射时间的延长，1O2的浓度不断增高，这与前期研究结果相一致[4]。经MTT试验确定Cu-Cy-Nanos的作用浓度和适宜的紫外激发时间。结果显示，细胞在紫外照射6 min后活性明显降低，25 μg/mL Cu-Cy-Nanos经过5 min的紫外激发后，对细胞的活性开始出现抑制作用。由此确定Cu-Cy-Nanos的适宜浓度为25 μg/mL，适宜紫外激发时间为5 min。有研究表明，Cu-Cy-Nanos具有抑制乳腺癌细胞增长的作用[10]，但并未对其他癌细胞的抑制效果进行评估。本研究对比了Cu-Cy-Nanos对3种不同癌细胞的抑制作用，结果表明，Cu-Cy-Nanos对3种不同的癌细胞的生长均具有一定的抑制作用，但不同癌细胞对Cu-Cy-Nanos的敏感性不同，Cu-Cy-Nanos对肝癌细胞的抑制作用最为明显。

综上，Cu-Cy-Nanos是一种靶向、ROS高产且对具有潜在的肝癌治疗效应的新型的光敏剂。这为今后对Cu-Cy-Nanos的研发及针对性的治疗研究提供了新的理论和实验依据。

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