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调控Rac1/AKT/NF-κB信号通路对呼吸机相关性肺损伤大鼠的影响*

更新时间:2009-03-28

机械通气是临床医疗中常用的重要的生命支持手段,但其使用不当会引起呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)[1],表现为肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的炎症损伤并释放白细胞介素(IL)-1β、 IL-6等炎症介质,进而介导肺内失控的“瀑布式”炎症反应[2-4]。目前认为,VILI的发病机制主要涉及气压伤、容积伤、剪切伤及生物性损伤等诸多因素,其中由胞内多种炎症信号通路激活导致的生物性损伤被认为是VILI发生的最主要原因之一[5]。Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)作为Rho小G蛋白家族的主要成员之一,在免疫细胞极化、黏附、跨膜、迁移及血管内皮细胞通透性改变和调控免疫细胞趋化中起到极其重要的作用,并在参与免疫应答的相关通路中占据重要地位[6]。本研究通过建立VILI大鼠模型,观察应用Rac1抑制剂NSC23766后VILI大鼠体内炎症因子变化,探讨Rac1蛋白在VILI发病中的作用及其机制。

2)顾客转换成本对医药B2C平台顾客忠诚度的影响值为 0.69。本研究也证实了在医药B2C购物环境下,通过培养顾客消费习惯、增加重复消费奖励等方式增加顾客转换成本,可以有效地提高顾客的忠诚度。

1 材料与方法

1.1 实验动物、分组及VILI模型建立

健康SPF级成年SD大鼠30只,体重240~260 g,雌雄不分,购于广西医科大学实验动物中心,动物合格证号:SCXK(桂)2014-002。大鼠适应环境1周后,将其随机分为3组:自主呼吸组、高潮气量(VT)组和Rac1抑制剂(NSC23766)组(NSC23766+40 mL/kg),每组10只。NSC23766购于美国Selleck公司。所有大鼠禁食8 h后,经腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)进行麻醉,充分麻醉后将其仰卧固定于手术台上,气管切开,行气管插管术,自主呼吸组保留自主吸呼作为对照,NSC23766组经气管导管缓慢滴入200 μL NSC23766干预1 h后,与高VT组同时连接呼吸机进行机械通气(VT=40 mL/kg)4 h,建立VILI模型[7-9]。呼吸机参数如下:呼吸比为1∶1,呼吸频率为8次/min,呼气末正压(PEEP)为0,吸入氧浓度(FiO2)为 0.21。手术过程中监测大鼠右侧颈总动脉血压,根据大鼠血压波动及体动反应及时追加10%水合氯醛0.3~0.5 mL维持麻醉。本实验对动物处置符合动物伦理学要求。

1.2 标本采集

大鼠机械通气4 h后开胸,经左心室穿刺采血,离心,取上清液;结扎左肺,用预冷无菌磷酸盐缓冲液(PBS)反复灌洗右侧肺泡,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),离心后取上清。血清、BALF及肺组织均置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 肺组织湿/干重比(W/D)值测定 取右肺下叶组织,滤纸吸干表面水分,称湿重后置入75 ℃恒温烤箱中烘烤3 d至恒重,测干重,计算W/D值以评估肺水肿程度。

1.3.2 肺组织病理学观察 取右肺中叶部分组织,用多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋、切片、苏木精—伊红(HE)染色,光镜下观察肺组织病理学改变。

1.3.3 BALF中总蛋白测定 用 BCA 法检测 BALF中总蛋白含量,操作按照BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书进行。

1.3.4 IL-1β、IL-6、Rac1含量检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清和 BALF 中IL-1β、IL-6含量以及BALF中Rac1蛋白的含量,操作严格按照 ELISA 试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)说明书进行。

1.3.5 反转录—聚合酶链反应(RT-PCR) 用Trizol法提取肺组织总RNA,反转录成cDNA后进行基因扩增。引物由日本TAKARA公司合成。PCR扩增条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火 30 s,共40个循环。用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量(△Ct=目的基因Ct值-内参Ct值)。

1.3.6 Western blotting 提取肺组织蛋白,离心取上清液,BCA法测定蛋白浓度后,加入蛋白上样缓冲液,100 ℃蛋白变性5 min。十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜、封闭后,加入一抗丝氨酸—苏氨酸蛋白酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、NF-κB和GAPDH,于4 ℃冰箱中孵育12 h,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(二抗)室温孵育1 h,ECL显影,ChemiDoc TM MP系统扫描分析灰度值,以目的蛋白与内参GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差)表示,多组变量比较采用单因素方差分析,组间两两比较方差齐者采用LSD-t检验,方差不齐采用Dunnett T3检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

与自主呼吸组比较,高VT组和NSC23766组的血清和BALF中的IL-1β、IL-6含量以及BALF中的Rac1含量明显增高(P<0.05),但NSC23766组血清和BALF中的IL-1β、IL-6含量以及BALF中的Rac1含量均显著低于高VT组(P<0.05),见表2。

2 结 果

2.1 3组大鼠肺组织W/D值和BALF中的总蛋白含量比较

为了进一步探讨作用机制,本实验应用Racl特异性抑制剂NSC23766,通过竞争Rac表面的鸟嘌呤核苷酸交换因子位点,靶向抑制Rac,但不抑制小G蛋白家族中另外两个重要成员Cdc42和RhoA[15]。研究发现,虽然NSC23766组Rac1的mRNA表达仍然较高,总AKT蛋白表达无明显变化,但p-AKT蛋白表达显著下降,下游的NF-κB的mRNA和蛋白表达亦下调,随之血清和BALF中IL-6和IL-1β也明显下降。上述下调因子的含量和自主呼吸组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。进一步表明Rac1/AKT/NF-κB通路参与了VILI的发生、发展,而NSC23766通过抑制下游蛋白磷酸化的方式阻断Rac1/AKT/NF-κB通路,从而在某种程度上减轻VILI大鼠的炎症反应。

表1 3组大鼠肺组织W/D值和BALF中的总蛋白含量比较

  

组别nW/D值总蛋白/(g/L)自主呼吸组104 33±0 017#0 52±0 08#高VT组105 89±0 651 57±0 50NSC23766组104 61±0 33#0 76±0 47#F14 86916 086P0 0010 001

与高VT组比较,#P<0.01。

2.2 3组肺组织病理学改变

光学显微镜下观察,自主呼吸组(图1A)肺泡正常;高VT组(图1B)肺泡间隔明显增宽,肺泡壁结构断裂,肺泡腔融合,大量炎性细胞聚集;NSC23766组(图1C)肺泡结构基本正常,肺间质轻度水肿,仅见少量炎性细胞浸润,见图1。

本课题组前期研究证实Rac1参与了VILI的发生[12],但机制尚未完全清楚。有研究表明,Racl与NF-κB密切相关[13],NF-κB通过介导多种炎性因子参与VILI的发展[14]。本研究结果显示,高VT组Rac1基因表达、BALF中Rac1的含量、总AKT和p-AKT蛋白表达量均显著增加,下游的NF-κB基因和蛋白表达量也明显上调,随之高VT组大鼠血清和BALF中的IL-6和IL-1β较自主呼吸组也明显增高,提示Rac1可能通过激活AKT/NF-κB信号通路,诱导下游炎性因子释放,从而介导VILI的发生和发展。

2.3 3组血清和BALF中的IL-1β、IL-6含量以及BALF中的Rac1含量比较

In this paper, the finite element model of bumper is established by using HyperMesh software, and it is calculated by ABAQUS software. Then to analyze the results of the collision simulation by the post-processing module of ABAQUS, and the following conclusions are drawn:

2.4 3组肺组织NF-κB和Rac1 mRNA及AKT、p-AKT、NF-κB蛋白表达比较

VILI是机械性损伤及生物伤共同作用的结果,异常机械应力作用于肺组织,激活了胞内信号转导,导致炎性细胞因子和介质释放,最终产生肺部和全身炎症反应[10-11]。本研究中,同自主呼吸组大鼠比较,高VT组大鼠过度通气(40 mL/kg)4 h后发生了明显的肺部损伤,光镜可见肺组织中肺泡腔融合、肺泡壁断裂、肺泡间隔增宽、大量炎性细胞聚集在肺泡腔,反映肺部通透性指标BALF中的总蛋白含量和W/D值均升高,提示造模成功,过度通气导致了机械大鼠肺组织发生急性炎症性损伤。

  

A:光镜下自主呼吸组肺组织无水肿和炎性细胞浸润;B:高VT组肺组织可见明显水肿,肺泡间隔增宽,肺泡充血,伴有大量炎性细胞聚集及肺泡结构紊乱;C:NSC23766组肺组织有轻微水肿及少量炎性细胞浸润。图1 3组肺组织病理学改变(HE,×40)

 

表2 3组血清和BALF中的IL-1β、IL-6含量以及BALF中的Rac1含量比较

  

组别nRac1含量/(μg/L)IL⁃6/(ng/L)IL⁃1β/(ng/L)血清BALF血清BALF自主呼吸组103 08±0 34#47 15±6 51#3 08±0 34#29 93±2 31#51 55±5 82#高VT组105 89±0 6588 95±2 63174 46±9 5253 60±3 5398 46±8 32NSC23766组104 61±0 33#66 13±1 86#101 43±6 08#40 00±3 52#73 87±3 52#F170 96976 314122 6342 96117 969P0 0010 0010 0000 0000 000

与高VT组比较,#P<0.05。

 

表3 3组肺组织NF-κB、Rac1 mRNA及AKT、p-AKT、NF-κB蛋白表达比较

  

组别n基因表达(2-△△Ct)蛋白表达(灰度值)Rac1NF⁃κBAKTp⁃AKTNF⁃κB自主呼吸组101 00±0 00#1 00±0 00#0 67±0 03#0 65±0 01#0 36±0 01#高VT组103 83±0 908 84±1 150 86±0 041 06±0 070 81±0 05NSC23766组102 17±0 08#4 16±0 08#0 81±0 02#0 66±0 03#0 40±0 03#F20 144106 36238 70496 927161 423P0 0010 0000 0000 0000 000

与高VT组比较,#P<0.05。

  

图2 AKT、p-AKT及NF-κB蛋白电泳图

3 讨 论

与自主呼吸组比较,高VT组和NSC23766组肺组织NF-κB和Rac1的mRNA表达均明显上调,且高VT组上调更为明显(均P<0.01)。高VT组和NSC23766组AKT蛋白表达高于自主呼吸组,差异有统计学意义(均P<0.05)。P-AKT和NF-κB蛋白的表达,高VT组的表达明显高于自主呼吸组和NSC23766组,差异有统计学意义(均P<0.05),见表3、图2。

1.识字材料选择难度化。人教版教材的识字材料文字中大量的韵语、成语、四字词语虽然有助于学生传统文化知识水平的提升,但有违背学生识字心理的可能性。见形而知音义,低年级的识字教学应以在学生头脑中建立字形为重难点,如果此时音义联系的陌生化再插入其中,无疑是给予识字教学当头一棒,使之难上加难。这种教学模式违背了第一学段学生的识字心理,有碍于识字教学的顺利开展,同样不利于学生语文学科素养的整体性提升。

与自主呼吸组和NSC23766组相比较,高VT组W/D值和BALF中的总蛋白含量明显增高(均P<0.01),而NSC23766组和自主呼吸组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

近年来,有关Rac1的研究越来越深入,与 Rac1相关的信号传导途径被逐渐阐明。Rac1是Rho超家族主要成员中的Rac亚家族,通过激活NF-κB的表达引起许多的炎性反应参与心房颤动或发挥对肿瘤恶性生物学活性的影响[16-18],同时,Rac1也通过调节多种炎性介质(IL-6、IL-33、IL-7等)参与哮喘、前列腺癌等疾病的发生发展[19-20]

综上所述,Rac1蛋白通过Rac1/AKT/NF-κB通路参与VILI的发生和发展,而加入Rac1抑制剂NSC23766后可以阻断细胞炎症信号的转导,从而减少炎性因子的释放,在一定程度上影响了VILI的进展。

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宋世雄,潘灵辉
《广西医科大学学报》2018年第04期文献

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