放射治疗是胸部恶性肿瘤治疗的重要手段之一，而胸部放疗引起的放射性肺损伤不仅降低了肿瘤局部控制率、患者远期生存率，而且降低了患者的生活质量。放射性肺损伤治疗相关靶点的确证已成为该领域的研究热点。核转录因子(nuclear transcription factor，NF)是一类与某些基因启动子区固定核苷酸序列结合并启动转录功能的蛋白质，NF-κB作为其中一组重要的蛋白质，参与了细胞分化、生存、增殖、免疫调节等多种病理过程。近年来，越来越多的研究表明NF-κB信号通路参与各种脏器组织炎症应答[1-3]，但对放射性肺损伤的调控作用尚不清楚。因此，本课题组通过建立大鼠放射性肺损伤模型，观察NF-κB p65、IκBα、白介素(IL)-1β mRNA在放射性肺损伤大鼠肺组织中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重180～220 g，购自广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(桂)2014-0002，使用许可证号：SCXK(桂)2014-0003。动物采用标准饲料喂养，给予自由饮水，动物房温度控制在(25±1)℃，湿度控制在(55±5)%，饲养3 d后无异常则进行随机分组。

1.2 动物分组及处理 将64只大鼠随机分为空白组和实验组，每组32只。空白组不做任何处理，实验组建立放射性肺损伤模型：大鼠采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧并固定于手术台上，用CT模拟定位机对大鼠肺脏进行扫描定位，黑色记号笔标出右肺轮廓，采用GWXJ80型60Co放射治疗仪(中国核动力研究设计院设备制造厂)，照射时用制作铅块挡住心脏及照射野外部，照射野采用单后野垂直照射，单次照射总剂量为18 Gy，照射野2 cm×3 cm，皮源距离80 cm，治疗深度2 cm，剂量吸收率为2.083 Gy/min。分别于实验开始后2周、6周、12周、24周，两组各取8只大鼠心脏采血后处死。

1.3 样本采集及检测方法 大鼠麻醉后，心脏穿刺采血，然后开胸取肺组织、拍照。(1)取右肺中叶置于4%多聚甲醛中固定48 h，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，行苏木精—伊红(HE)染色、Masson染色，200倍光镜下观察肺组织病理变化。(2)取右肺下叶组织，匀浆后取上清液，采用样本碱水解法测定羟脯氨酸含量，试剂盒购自南京建成生物有限公司。(3)心脏采血后，离心取血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中IL-1β水平，试剂盒购自武汉华生物工程有限公司。检测过程严格按照试剂盒说明书操作，用ELx800全自动酶标仪(BioTek)测定各孔吸光度值，绘制标准曲线，计算大鼠肺组织羟脯氨酸含量和血清IL-1β浓度。

1.4 荧光定量PCR(qPCR) 提取肺组织RNA，逆转录成cDNA，采用ABI StepOne Plus实时荧光定量PCR仪进行扩增，PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，共40个循环；添加熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH作为内参，用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。 引物序列如下：NF-κB p65上游：5’-AACAACACAGACCCAGGAGT-3’，下游：5’-CTGTCACCAGGCGAGTTATAG-3’[4]；IκBα上游：5’-TGACCATGGAAGTGATTGGTCAG-3’，下游：5’-GATCACAGCCAAGTGGAGTGGA-3’；IL-1β上游：5’-GCACAGTTCCCCAACTGGTA-3’，下游：5’-AAGACACGGGTTCCATGGTG-3’； GAPDH上游：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGA-ATG-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’，均由大连宝生物公司设计并合成。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验或Dunnett’s T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺组织大体观察、HE、Masson染色 空白组肺组织呈鲜粉红色,表面光滑,质地软且饱满,弹性好，肺泡和肺间质组织无充血、水肿,结构完整。实验组照射后2周末,肺组织稍有水肿,体积略增大,毛细血管轻度充血,部分肺泡上皮脱落;6周末时,肺组织进一步肿胀、体积进一步增大，右肺泡间隔增厚,并有炎症细胞浸润,肺泡间隔可观察到少许胶原纤维沉积;12周末时,可见大鼠肺组织逐渐萎缩,质地变韧,可见局部肺泡消失，肺泡壁及间隔出现大量增生的纤维细胞,肺泡腔缩小,肺泡壁继续增厚，纤维沉积较前增加;24周末时，可见大鼠肺组织萎缩、表面不平整,有较为明显的片状灰白色区域,部分肺泡腔被结缔组织代替、融合、实质化,大量成纤维细胞增生并形成片状纤维化灶,见图1。

2.2 羟脯氨酸含量 空白组大鼠各时间点羟脯氨酸含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。实验组羟脯氨酸含量随照射后的时间延长逐渐增加，照射后6周、12周、24周的羟脯氨酸含量均明显高于空白组(均P<0.05)，见表1。

2.3 血清IL-1β水平的变化 空白组大鼠不同时间点血清IL-1β水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠照射后各时间点血清IL-1β水平均高于空白组(均P<0.05)，IL-1β浓度在照射后6周达到峰值，之后逐渐回落，见表2。

2.4 大鼠肺组织NF-κB p65、IκBα、IL-1β mRNA相对表达量 空白组大鼠不同时间点NF-κB p65、IκBα、IL-1β mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。实验组大鼠照射后各时间点NF-κB p65、IL-1β mRNA相对表达量高于空白组，而IκBα mRNA相对表达量低于空白组(P<0.05)。实验组NF-κB p65、IL-1β mRNA相对表达量从照射后2周末开始升高，6周末达到峰值，之后缓慢回落，而IκBα mRNA相对表达量趋势相反，见表3。

  

A1～A5组：肺组织大体观察；B1～B5组：HE染色；C1～C5：Masson染色。图1 空白组及实验组照射后不同时间点肺组织大体观察、病理形态图(×200)

 

表1 两组大鼠照射后不同时间点肺组织羟脯氨酸含量比较

  

组别n2周6周12周24周空白组320 658±0 0850 651±0 0980 671±0 0830 707±0 079实验组320 832±0 1270 963±0 109∗1 369±0 089∗#1 727±0 149∗#

与空白组比较，*P<0.05；与同组其它时间点比较，#P<0.05。

 

表2 两组大鼠照射后不同时间点血清IL-1β水平比较

  

组别n2周6周12周24周空白组3276 734±3 61177 677±3 19378 427±3 05480 731±5 264实验组3297 749±4 267∗134 661±4 539∗#119 084±3 834∗#102 056±4 3648∗#

与空白组比较，*P<0.05；与同组其它时间点比较，#P<0.05。

 

表3 两组照射后不同时间点肺组织NF-κB p65、IκBα、IL-1β mRNA相对表达量比较

  

指标组别2周6周12周24周NF⁃κBp65空白组1 009±0 1341 020±0 1961 016±0 2021 020±0 215实验组3 794±0 786∗8 549±1 299∗#5 092±0 966∗4 232±1 035∗IκBα空白组1 003±0 0771 009±0 1321 004±0 0961 008±0 127实验组0 517±0 088∗0 331±0 084∗#0 565±0 115∗0 664±0 107∗IL⁃1β空白组1 007±0 1191 010±0 1461 014±0 1731 004±0 090实验组2 072±0 308∗3 942±0 554∗#2 548±0 457∗1 840±0 314∗

与空白组比较，*P<0.05；与同组其它时间点比较，#P<0.05。

3 讨 论

随着放射治疗的不断深入，放射性肺损伤带来的危害日益受到人们的关注。放射性肺损伤的发病机制尚未完全阐明，目前较为认可的是“细胞因子级联”学说[5]。放射性肺损伤可分为早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化两个阶段。肺纤维化一旦形成，造成的损伤不可逆转，因此预防及放疗前干预用药往往比后续治疗更为重要。IL-1是一类具有广泛生物效应的前炎性因子，由肺泡上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等分泌产生。其中，IL-1β是IL-1家族中较为重要的同源蛋白质。研究表明，IL-1β可以诱导促进TNF-α、IL-6等炎症因子的表达而引起急性肺损伤[6]；在二氧化硅相关肺炎模型中， IL-1β还可以被诱导产生而进一步启动Th17细胞应答机制，从而促进炎症的发生、发展[7]；此外，在被H1N1流感病毒感染的肺微血管内皮细胞和成纤维细胞中，IL-1β受体被抑制或消除，亦能减轻肺炎症[8]。以上机制均表明IL-1β与肺部炎症的发生、发展密切相关。NF-κB是一组转录因子蛋白家族，由Rel(cRel)、p65(RelA, NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)5个成员组成。潜伏阶段时NF-κB信号通路中p65与p50可形成异二聚体而与其抑制物IκBα结合而保持下游基因的沉默状态[9]，当受到某些炎症因子(如IL-1)的刺激后，IκBα可被上游的IKKα、IKKβ及IKKγ组成的复合体磷酸化，IκBα随之泛素化并降解，并释放出p65-p50异二聚体进入细胞核，调控并促进IL-1、TNF-α、Cox-2等炎性反应因子的转录，形成了正反馈环并导致了细胞因子的“级联瀑布”，最终引起和加剧了炎性反应[10-11]。

部编教材的最大特点和最大优势是“双线组织单元结构”，主要分为两个单元，即“内容主题”和“语文要素”，有识字、课文、语文园地、口语交际以及快乐读书吧五个板块。在识字方面，鼓励学生多认识文字，对写字的要求相对而言不高。总体来说，部编教材相对于人教版课文而言数量有所减少，但教学内容变得更加丰富，增加了课外阅读和写作板块。并且，传统文化篇目的数量也随之增加，留下了经受住时间考验的文化经典，而少了近代的篇目。结构体例更加科学，更适合当代学生的学习与发展。

笔者比较赞成渐进式的改革方式，分批进行税制改革。首先这一方式符合我国一贯的改革传统，有利于广大群众接受，并且可以在改革的过程中不断解决问题，借鉴改革经验，促进改革成熟，综合考虑我国各个行业的发展现状短期内对金融、地产等行业改革难度比较大，因此可以先对其他相对容易的行业进行改革。

本研究通过单次18 Gy照射大鼠右肺，发现实验组早期可出现肺组织水肿、毛细血管充血、肺间质增厚、炎症细胞浸润、羟脯氨酸含量增加等；晚期时，可见大鼠肺组织出现弹性变差，质地变韧，肺泡腔被结缔组织代替、融合、实质化，有纤维化灶形成，羟脯氨酸明显增加，而空白组大鼠在这些时间点中的肺泡结构完好，表明放射性肺损伤模型建立成功。此外，实验组血清IL-1β浓度、IL-1β及NF-κB p65 mRNA相对表达量均高于空白组，而IκBα mRNA相对表达量低于空白组(P<0.05)，且随着照射时间延长，NF-κB p65 mRNA相对表达量呈先升高后回落趋势，这与曹振等[12]及Cheng等[13]报道的结果相似，IL-1β mRNA相对表达量先升高后回落，而IκBα mRNA表达趋势相反，推测可能由于大剂量γ射线造成大鼠肺损伤后，早期(照射后2周、6周)肺组织损伤而引起炎症反应，导致炎症相关细胞因子IL-1β、NF-κB p65 mRNA的大量表达，而炎症抑制物Iκbα mRNA的表达受到抑制；在后期(照射后12～24周末)，随着炎症的吸收和逐渐消退，炎症因子表达逐渐回落，Iκbα mRNA的表达也逐渐回到较高水平。此外，放射性肺损伤后6周末炎症因子表达达到高峰，可能是由于放射性肺损伤引起各种炎症细胞募集，并促使炎症因子(IL-1β、TNF-α等)的表达，后者进一步激活下游NF-κB信号通路而导致NF-κB p65磷酸化并入核，入核后的NF-κB p65又可以调控IL-1、IL-6、TNF-α等炎症细胞因子的表达，形成一个正反馈循环并造成炎症因子的“级联瀑布”，最终导致和加剧了放射性肺炎。但由于本实验缺乏对该通路上下游相关蛋白及磷酸化的表达水平的检测及基因沉默、基因抑制等方法的实施，无法对此进行论证，因此，具体机制仍有待进一步探索。

综上，NF-κB p65、IκBα、IL-1β参与了放射性肺损伤的发生、发展，对这些因子或相关信号通路进行干预，可能达到抑制放射性肺损伤的目的。

参考文献：

[1] SARI A N，KORKMAZ B，SERIN M S，et al. Effects of 5,14-HEDGE,a 20-HETE mimetic, on lipopolysaccharide-induced changes in MyD88/TAK1/IKKβ/IκB-α/NF-κB pathway and circulating miR-150, miR-223, and miR-297levels in a rat model of septic shock[J]. Inflammation Research,2014,63(9):741-756.

[2] KWON W Y，SUH GJ，KIM K S，et al. Niacin attenuates lung inflammation and improves survival during sepsis by downregulating the nuclear factor-κB pathway[J]. Critical Care Medicine,2011,39(2):328.

[3] FU J，SHI Q，SONG X，et al. Tetrachlorobenzoquinone exhibits neurotoxicity by inducing inflammatory responses through ROS-mediated IKK/IκB/NF-κB signaling[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2016,41:241-250.

[4] HIRAO S，K MINAKAT A，H MASUMOTO，et al. Recombinant human soluble thrombomodulin prevents acute lung injury in a rat cardiopulmonary bypass model[J].Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery,2017,154(6):1973-1983.

[5] TROTT K R，T HERRMAN N，M KASPE R.Target cells in radiation pneumopathy[J]. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2004，58(2):463.

[6] KOLB M， MARGETTS P J， ANTHONY D C， et al. Transient expression of IL-1β induces acute lung injury and chronic repair leading to pulmonary fibrosis[J]. The Journal of Clinical Investigation，2001，107(12):1529-1536.

[7] CHEN Y，SONG Y L，WENG D，et al. Th17 can regulate silica-induced lung inflammation through an IL-1β-dependent mechanism[J]. J Cell Mol Med, 2014,18(9):1773-1784.

[8] KIM K S，JUNG H，SHIN I K，et al. Induction of interleukin-1 beta (IL-1β) is a critical component of lung inflammation during influenza A (H1N1) virus infection[J]. Journal of Medical Virology,2015,87(7):1104-1112.

[9] HAYDEN M S，GHOSH S. NF-κB, the first quarter-century:remarkable progress and outstanding questions[J]. Genes & Development, 2012,26(3):203.

[10] WEBER A，WASILIEW P，KRACHT M. Interleukin-1 (IL-1) pathway[J]. Science Signaling, 2010,3(105):cm1.

[11] GHOSH S，HAYDEN M S.Celebrating 25 years of NF-κB research[J]. Immunological Reviews, 2012,246(1):5-13.

[12] 曹 振，谢丛华，周福祥，等.当归对小鼠放射性肺损伤中NF-κB的影响[J].中华放射医学与防护杂志，2008，28(1):24-27.

[13] CHENG W, XIAO L,AINIWAER A, et al. Molecular responses of radiation-induced liver damage in rats[J]. Molecular Medicine Reports，2015,11(4):2592-2600.