经过十余年的努力，我国HIV母婴传播得到了一定遏制，但由于流动人口问题和感染人群的特殊性，我国HIV母婴传播工作仍面临挑战。我们所面临的问题是关注高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)药物安全性问题，保障HIV感染母亲分娩的HIV阴性孩子远期的生存质量。有研究显示[1-2]，应用抗逆转录病毒药物预防HIV母婴传播可能出现副作用，如齐多夫定(zidovudine，AZT)可导致骨髓抑制，出现贫血及中性粒细胞减少等。但临床观察发现，孕期AZT暴露的新生儿在停药或换药6～12个月后，婴儿的外周血指标均基本恢复，并不需要特别的提升造血系统能力的治疗。这提示虽然AZT有骨髓抑制的副作用，但新生儿或婴儿的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)估计可有限度地拮抗AZT的线粒体毒性，其具体机制尚未清楚。AZT多损伤或抑制造血祖细胞，故在AZT作用下，新生个体(人或小鼠)依然维持一定的HSCs自我更新能力及活性，为后续血液系统的恢复提供细胞学基础。本研究通过动物模型检测AZT对小鼠骨髓单个核细胞的HSCs自我更新相关信号通路PI3K/Akt/mTOR和相关分子Bmi-1的变化规律，明确AZT干预对HSCs影响的分子机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据实验目的分为以下4组：(1)正常新生小鼠(正常组)，6只；(2)新生小鼠组，AZT宫内暴露的新生小鼠(3 d内)：Balb/c孕小鼠AZT干预，干预时间为孕期第10天至分娩，AZT剂量为5.0 mg/d/只(AZT 5.0 mg组)和10.0 mg/d/只(AZT 10.0 mg组)，新生小鼠分别为8只和7只；(3)成年小鼠组，8周龄小鼠6只；(4)老年小鼠组，24周龄小鼠5只。

总之，语文学科素养的落地离不开语文课堂教学过程中对学生阅读和表达能力的培养。阅读和表达能力的培养是提升学生语文学科素养的根本途径和基本手段。若是离开了阅读和表达能力的培养，语文学科素养的培养就会成为无源之水、无本之木。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓单个核细胞分离与培养 小鼠采用吸入乙醚深度麻醉后处死，将小鼠置于碘酒浸泡1 min，75%酒精浸泡2 min脱碘；分离出股骨, 去除肌肉等表面的附着软组织，用注射器刺穿干垢端，用2 mL注射器吸取2 mL预冷的RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)，对股骨骨髓进行冲洗取材，将骨髓细胞吹到培养皿内，直至股骨变白。用吸管反复轻轻吹打成细胞悬液，转到10 mL离心管，4 ℃、1 500 r/min离心5 min。弃上清，加入1 mL的RPMI-1640培养液重悬细胞沉淀，加入5倍体积的红细胞裂解液，室温作用2 min，4 ℃、1 500 r/min离心5 min；若红细胞过多，可重复1次；用1 mL的注射器吸取细胞悬液，在通过针头过滤细胞悬液。RPMI-1640 培养液冲洗细胞沉淀2次，离心5 min，细胞沉淀用2 mL的RPMI-1640培养液重悬。在5 mL离心管内加入1.090 g/mL的淋巴细胞分离液2 mL，4 ℃、2 000 r/min离心25 min，吸取中间细胞层。RPMI-1640 培养液冲洗2次，每次离心5 min，弃去上清液，加入骨髓造血干/祖细胞培养基，重悬骨髓单个核细胞，以1×106个细胞/mL的密度接种于6孔板中，在37 ℃、5% CO2、湿度100%条件下培养24 h，全量换液，离心5 min，加入Stemspan TM培养液继续培养24 h，全量换液后，进行AZT暴露干预培养24 h。

1.2.2 qPCR检测 引物序列如下：PI3K F: CTGGAACAGCGCTCACCTTTGTTT，R: ACCATGACTTTAGCGAGCTCCACA；Akt F:CACACCCAGTTCCTGCCTG，R:CCTGGTGGGCA-AAGAGGGC；mTOR F:CTT TCTAGA AACTGGAGGCCCAG， R:TGGTGTCTAGACATGGCTACACTTTATA C；Bmi-1 F: CTGGTTGCCCA-TTGACAGC，R:CAGAAAATGAATGCGAGCCA；PTEN F：ATACCAGGACCAGAGGAAACC，R：TTGTCATTATCCGCACGCTC；β-actin F: CGCTCCGGCCCACAAATCTC，R:CCGCACGACAACCGCACCAT。反应体系按照Real Master Mix (SYBRGreen)(日本Takara公司)试剂盒配置，PCR反应前10个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为Ct值。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.2.3 Western bloting检测 用冷PBS洗细胞3～4次，加入细胞裂解液置冰上裂解细胞30 min，收集细胞；最大功率脉冲超声30 s，4 ℃、12 000 r/min离心30 min去除细胞碎片，取上清液；样品置于-70 ℃冰箱中保存待用，用BCA试剂盒(上海生物工程公司)测定蛋白浓度；蛋白95 ℃加热变性后，取40 μL蛋白样本，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维膜，用封闭液室温封闭1 h，加入小鼠一抗4EBP1(美国Santa Cruz公司，1∶100)、P70S6(美国Santa Cruz公司，1∶100)、β-actin(英国abcam公司，1∶2 000)于4 ℃冰箱中孵育过夜，洗膜15 min×3次，加入山羊抗小鼠二抗(美国Santa Cruz公司，1∶2 000)室温孵育1 h，洗膜15 min×3次；ECL显色，X线片曝光、扫描。以目的蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠骨髓单个核细胞PI3K、Akt、mTOR与Bmi-1、PTEN基因表达

AZT 10.0 mg组和AZT 5.0 mg组PI3K/Akt/mTOR信号通路中，mTOR 水平表达有升高趋势，与成年小鼠组比较无明显差异(P>0.05)，但明显低于老年小鼠组(P<0.05)，而PTEN基因的表达无明显变化(均P>0.05)；AZT 10.0 mg组和AZT 5.0 mg组Bmi-1基因表达水平较正常组和成年小鼠组高(均P<0.05)，但明显低于老年小鼠组(P<0.05)；AZT 10.0 mg组Akt、mTOR、Bmi-1表达较AZT 5.0 mg组有升高趋势，但差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

 

表1 各组小鼠骨髓单个核细胞PI3K、Akt、mTOR、Bmi-1、PTEN基因

  

组别nPI3K(10-4)Akt(10-3)mTOR(10-4)Bmi⁃1(10-2)PTEN(10-2)正常组66 12±3 288 39±6 744 89±2 769 31±5 194 61±2 54AZT5 0mg组87 28±2 467 31±3 7510 98±3 67∗#20 18±8 14∗&#4 51±3 25AZT10 0mg组77 45±4 319 38±7 2411 54±4 32∗#28 49±10 18∗&#4 18±2 65成年小鼠组67 24±2 866 94±3 217 86±5 1814 56±4 136 71±3 49老年小鼠组56 93±4 538 41±4 8118 82±6 75&66 19±15 42&5 38±2 36

与正常组比较，*P<0.05；与老年小鼠组比较，#P<0.05；与成年小鼠组比较，&P<0.05。

2.2 各组小鼠骨髓单个核细胞mTOR下游活化蛋白P70S6和4EBP1D表达情况

在这句话的翻译中，分别把their families’shock and disapproval和 the stares and unwelcome comments of strangers这两个名词词组译作句子，没有按照原文形式进行对等，而进行意义对等。由于汉语是意合语言，英语是形合语言；汉语中不像英语有许多关联词来链接句子，因此将名词短语译成句子，加入一定的解释，使得译文通顺可读。这既是经权关系的变化与统一，也是解释学中理解与运用的统一。此外，翻译时还需根据句子的逻辑结构，适当调整句子的语序，这样译文就会不仅忠实于原文，而且连贯易懂，语义和谐。

阅读一篇优秀的诗文就像在与作者进行对话，进行思想的交流；美的文章能给我们美的享受，给我们心灵的震动，丰富我们的内心世界，丰富我们的语言。而学生的语言积累丰富了，饱满了，其表达也是富有情感的。

表2 各组小鼠骨髓单个核细胞mTOR下游活化蛋白P70S6与4EBP1D表达情况

  

组别nmTOR下游蛋白P70S64EBP1D正常组60 16±0 110 18±0 16AZT5 0mg组80 39±0 15ab0 46±0 18abAZT10 0mg组70 56±0 14ab0 48±0 12ab成年小鼠组60 31±0 220 28±0 18老年小鼠组50 82±0 26ac1 21±0 31ac

与正常组比较，aP<0.05；与老年小鼠组比较，bP<0.05；与成年小鼠组比较，cP<0.05。

3 讨 论

为了既维持成熟血细胞的补给又不使干细胞在机体预期生命期限耗尽，多数HSCs保持静止，仅仅少数细胞进入细胞周期。HSCs的细胞周期过程中受到细胞因子调控，同时受到骨髓中基质细胞和细胞外环境的影响。另一方面，通过调控HSCs内源性转录因子的表达，包括c2Myc、GATA22、HOX家族蛋白和Bmi-1，维持HSCs和祖细胞静止，调节可利用的细胞池比例[3]。HSCs在体内受细胞外造血微环境和细胞内多种重要信号通路的调节，主要包括SCF/c-Kit，TPO/c-Mpl，Ang-1/Tie2，TGF-β/Smad，Wnt等[4]。

mTOR属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)蛋白家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR的上游信号传导途径包括PI3K/Akt/mTOR信号通路和AMPK-mTOR信号传导途径。其中PI3K/Akt/mTOR通路尤其重要，是调节细胞生长分化、代谢的重要通路，受到白介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、胰岛素样生长因子、表皮生长因子等细胞因子和生长因子的活化[6]，激活PI3K和Akt，活化的Akt可以直接磷酸化mTOR而激活，也可以间接抑制负性调控复合体TSC1/TSC2的形成，解除其对mTOR抑制，使PI3K/Akt/mTOR通路活化。核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)和真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4EBP1)均是mTOR的下游效应分子[7-8]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与许多重要生物学过程的调控，它在调节细胞生长和生存中起着关键性的作用。近年来发现，mTOR信号通路过度活化可导致HSCs脱离静止状态而激活，最终导致造血干细胞池的耗竭。抑制mTOR过度活化，就可恢复HSCs的自我更新能力，是造血恢复的细胞学基础[5]。

本文实验中，各组小鼠骨髓细胞PTEN基因的表达没有差异，提示AZT暴露导致造血干/祖细胞抑制，可能与PTEN基因表达与调控异常关系不大。本研究发现，mTOR信号通路与年龄关系密切，24周龄老年小鼠的mTOR、4EBP1和P70S6K的表达水平升高，此外，有研究也发现，老年小鼠的mTOR信号通路活性较新生鼠成体鼠水平显著升高，表现为mTOR、4EBP1和P70S6K的蛋白磷酸化水平升高[17-18]。老年小鼠的造血系统改变则表现为自我更新能力、造血能力和分化成淋巴细胞能力下降，出现如贫血、淋巴细胞增殖活性降低、造血重建能力低下，称之为HSCs衰老。若针对老年小鼠施加mTOR靶向抑制剂，下调过度活化的PI3K/Akt/mTOR通路，则可以在一定程度上恢复造血活性，即恢复HSCs的自我复制能力。

此外，PTEN是肿瘤抑制基因，定位于人类染色体10q23.3，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有高度保守性，表达于人体多种组织，参与调控细胞的增殖与凋亡，发挥抑癌蛋白的作用。可以通过抑制Akt活化，成为PI3K/Akt/mTOR通路的负性调控因子[9-11]。PTEN的低表达或者失活能够增强PI3K/Akt信号通路活化，从而促进细胞生长、转化、迁移、代谢以及血管生成[12-13]。PTEN还可以通过抑制mTOR的活性参与细胞周期的进程，导致细胞周期阻滞[14]。近年来认为PTEN蛋白可能通过其磷酸酶活性抑制多重信号传导通路，而PTEN的异常调控与白血病的发病有关[11,15]。在白血病患者及细胞系中，PTEN基因及蛋白表达减低或缺失常见，而基因重排及突变罕见[16]。

各组小鼠骨髓单个核细胞mTOR下游活化蛋白P70S6与4EBP1D表达情况， AZT 10.0 mg组和AZT 5.0 mg组P70S6、4EBP1D较正常组升高但低于老年小鼠组(P<0.05)，老年小鼠组上述蛋白表达高于正常组和成年小鼠组(P<0.05)，见表2。

本研究用AZT干预孕鼠，新生鼠则长期暴露于较高浓度AZT中，mTOR、4EBP1和P70S6K蛋白表达水平升高，有超过成年小鼠的趋势，但仍显著低于老年小鼠水平，提示AZT已经导致HSCs的机能损伤，新生儿临床表现为HSCs衰老倾向，如CFΜ-GM、BFΜ-E和CFΜ-Meg集落数减少，外周血红系、粒系、淋巴系以及血小板数目有减少趋势。但本研究发现，mTOR水平并没有过度升高而达到老年大鼠mTOR水平，仅略高于成年鼠水平，提示AZT对新生鼠HSCs自我更新相关信号通路关键分子mTOR的影响有限。

一些研究结果显示，纯化的鼠和人HSCs均表达高水平的Bmi-1，缺乏Bmi-1的HSCs不能持续到成年期[19]。增加Bmi-1的表达能促进HSCs自我更新，Bmi-1表达能增强HSCs的对称分裂，并通过干细胞分裂调高遗传概率。重新转染Bmi-1能导致体内祖细胞多种潜能的扩增，并使HSC在体内再植入能力显著增加，因此，Bmi-1是HSCs自我更新的中心角色[20-22]。本研究结果显示，宫内AZT暴露两组Bmi-1基因表达水平较正常新生鼠和成年小鼠高，说明AZT暴露可能导致小鼠HSCs自我更新增强。而研究中Bmi-1基因表达尚低于老年大鼠水平，因此可以设想，由于新生鼠或新生儿(无HIV感染者)，其HSCs活性如自我更新等能力是非常强大的，即使有AZT导致的HSCs衰老趋势，但依然维持一定的自我更新活性，估计处于成体的HSCs活性水平，这样的改变可以解释为在AZT暴露停止后，不干预或稍加干预，血液系统便可基本恢复。但鉴于AZT暴露引起新生儿线粒体毒性缺乏长期观察的流行病学资料，应该慎重对待HSCs的AZT损伤。此外，PI3K、Akt、PTEN等基因变化不大或没有像Bmi-1基因与mTOR有相关变化，提示年龄调控mTOR通路的因素需要进一步研究。宫内AZT暴露的新生小鼠的PI3K/Akt/mTOR信号通路中，mTOR、Bmi-1基因表达水平明显低于老年小鼠，AZT对新生鼠HSCs自我更新相关信号通路关键分子mTOR与Bmi-1存在有限的影响，仍能维持在较为正常的调控水平。

季羡林教授“偷”时间最为辛苦。他曾长期兼任大学系主任和副校长职务，不得不出席很多会议，这对于一个惜时如金的学者来说是很痛苦的。但他也有自己的办法，除了早起晚睡、加班加点，他还在一些无关紧要的会议期间想自己的学问，为文章打腹稿，列提纲，就利用这偷出来的时间，他写出了好几本脍炙人口的散文集。

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