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核桃叶多酚含量的测定和抗氧化能力的研究

更新时间:2009-03-28

核桃(Juglans regia)是胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)落叶乔木,在我国栽培历史悠久,分布广泛,华北、西北、西南各省都有栽培,主要以山东、河南、陕西、甘肃、四川、贵州及新疆的南部所产最多(图尔贡江·伊力亚则等,2015;翟梅枝等,2011)。近年来对核桃的研究主要集中在核桃仁、核桃青皮、核桃油等果实的利用方面,然而对于核桃叶的研究相对较少。常仁龙等(2009)研究表明核桃叶中除了含有多种营养物质,如维生素、胡萝卜外,还含有大量的醌类、多酚类、苷类、黄酮类等具有生物活性的物质。核桃叶的药理功能,我国民间早有记载,其制剂能改善新陈代谢,促进肌体强壮,对患维生素缺乏症、喉头炎、淋巴结、甲状腺肿大、结核病、黄胆病、妇科病、皮肤病等均有较好疗效(潘亚琴等,2008);核桃叶制茶,保健食品等方面的开发也有报道。尉芹等(2001)用乙醇、丙酮、水等提取溶剂提取核桃叶,结果表明提取物均有很强的抗氧化作用,其中以丙酮提取物抗氧化作用最强。何丽波等(2012)通过比较不同的采摘月份核桃叶提取物的抗氧化性,分析采摘时间与抗氧化性之间的关系,结果表明9月份采摘的核桃叶丙酮提取物的抗氧化能力最强。然而关于抗氧化作用的具体化合物的酚类结构类型,以及多酚的含量与抗氧化能力之间的量效关系的研究很少报道。

植物多酚是多羟基类化合物的总称,又称为单宁,为植物体内复杂的酚类次生代谢产物,主要存在于植物的皮、根、叶、果实中,易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮,不溶于氯仿、苯等有机溶剂(赵扬帆和郑宝东,2006)。近年来的研究发现植物多酚具有防治心血管疾病、抗炎、抗癌、抗氧化、抗衰老等广泛的药理活性,引起了人们的极大关注。为进一步地研究核桃叶中多酚的含量,并建立一个测量核桃叶中多酚的测定方法,同时研究多酚的含量与其抗氧化能力之间的关系。本研究采用乙醇作为提取溶剂,并分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,并测定各部分的多酚含量及抗氧化能力,研究其生物活性,既可为医疗、农业、食品等各行业提供研究思路和方法,又可以使核桃属植物的副产物得到合理的利用,减少资源的浪费和环境的污染。

气动阀门具有结构简单、输出推力大、维护便捷等优点,加压过滤机采用1台DN200气动蝶阀(入料)与1台DN80气动蝶阀(回料)构成连锁入料系统。正常入料时DN200闸门打开,DN80闸门关闭。仓内液位高时,入料阀关闭,同时回料阀打开,使物料重新回到入料池。运行期间,仓内始终存在180~250 kPa的压力,给料泵的压力最小维持在400 kPa。阀门长期受正反水压冲击,尤其是在开关瞬间。过快的切换速度使阀门受力加倍,物料形成力量强大的水锤,反复冲击闸柄。所以,在这种情况下运行,气动闸门的故障率较高,在闸芯正常磨损前,闸柄往往受冲击断裂。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜的核桃叶于2016年7月购买于广西壮族自治区河池市凤山县,经广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所黄俞淞副研究员鉴定为胡桃科(Juglandanceae)胡桃属核桃(Juglans regia),凭证标本保存于广西植物功能物质研究与利用重点实验室。

1.2 仪器

HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);FN101-2A 鼓风干燥箱(长沙仪器仪表厂);R-200型旋转蒸发仪(Buchi Labortechnik AG CH-9230);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英予华仪器厂);JA2003N 电子天平(上海菁海仪器有限公司);电子天平XS225A-SCS(Precisa);T6 新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

社区大学教师专业发展属于教师专业发展的范畴,而理解社区大学教师专业发展内涵时则需要从成人教育视角和社会发展的需要两方面展开。

1.3 试剂

无水乙醇(AR,西陇化工股份有限公司,批号为110601);无水碳酸钠(AR,广州化学试剂厂,批号为830902);没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所);福林酚试剂(GOLDWHEAT);抗坏血酸(VC,中国药品生物制品检定所);纯净水;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,美国Sigma 公司); 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS,美国Sigma公司);其它试剂均为分析纯。

1.4 方法

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1.4.2 没食子酸标准曲线的建立 分别精密吸取0,60,120,180,240,300 μL没食子酸对照品溶液于试管中,加入Folin-酚试剂1 mL,混匀后静置5 min,加入7.5%的Na2CO3溶液3 mL,加水至10 mL,于40 ℃水浴暗置60 min。760 nm波长下测定样品的吸光度,以没食子酸为标准品建立的标准曲线为Y = 14.339X+0.003 7(n=7,R2=0.999 4),说明没食子酸在0~36 μg范围内吸光度与含量具有良好的线性关系。

1.3 方法 采用放射免疫分析法检测母血和脐血中瘦素、IGF-1水平,瘦素试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司,IGF-1试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司。所有操作均严格按照试剂盒要求进行。采用全自动生化分析仪(美国Beckman Coulter公司)测定母血和脐血内三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。

1.4.3 供试样品溶液的配制 新鲜的核桃叶2.35 kg,阴干后粉粹,加入40 L 75%的乙醇,室温浸泡提取3次,每次5 d,减压浓缩提取液后,得浸膏434.7 g 。浸膏分别用适量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,然后浓缩干燥,得石油醚部分(24.9 g),乙酸乙酯部分(25 g),正丁醇部分(24.4 g),水部分(85.8 g)。分别精密称取石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分、水部分、Ext.干浸膏20 mg,各加入50%乙醇超声溶解,转移到100 mL容量瓶中,定容到刻度,摇匀,备用。分别精确移取上述供试样品0.1 mL,按1.4.2显色方式显色,测得各部分样品吸光度。

DPPH·清除率= [A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100%。

1.4.4 DPPH·自由基清除能力 采用80%的乙醇溶液分别配制核桃叶的提取物及各萃取部分一系列不同质量浓度的样品溶液(0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75 mg·mL-1),精密移取0.5 mL的样品溶液于PE试管中,再加入0.5 mL的DPPH·乙醇溶液(0.394 g·L-1)混匀,37 ℃水浴避光反应30 min,于室温下测定各样品在517 nm的吸光度,抗坏血酸(VC)作阳性对照,按照以下公式计算DPPH·清除率,并计算提取物及各部分样品的半清除率质量浓度(IC50)值(刘春丽等,2014;朱霞等,2014;WANG et al,2015)。

式中,A空白为1 mL的ABTS·溶液与0.2 mL 80%的乙醇溶液的吸光度,A样品为样品溶液的吸光度,A对照为0.2 mL样品溶液和1 mL 80%乙醇溶液的吸光度。

式中,A空白为0.5 mL DPPH·溶液与0.5 mL 80%乙醇溶液的吸光度,A样品为样品溶液的吸光度,A对照为0.5 mL 80%乙醇溶液和0.5 mL样品溶液的吸光度。

精密度实验中计算得到RSD值为0.045%,说明该仪器精密度良好。稳定性实验中经过计算得到RSD值为0.19%,表明该样品在显色后210 min内稳定性良好。重现性实验中计算得到RSD值为0.52%, 说明该方法重现性良好。通过精密度实验、 稳定性实验、重现性实验表明该方法用来测定样品的总酚含量科学有效。加样回收率实验中,得到样品的平均回收率为99.45%, RSD为0.97%表明该方法具有较高的准确性。

ABTS·清除率=[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100%。

导数作为函数在某一点处的瞬时变化率刻画了函数变化趋势(上升或下降的陡峭程度),而函数的单调性也是对函数变化趋势的一种刻画,那么导数与函数的单调性有什么联系呢?(教师通过用超级画板演示曲线上点在运动的过程中,提醒学生注意观察切线的斜率符号的变化.)

2 结果与分析

2.1 核桃叶的多酚含量

2.1.1 没食子酸标准曲线 以没食子酸为标准品建立的曲线方程为Y=14.339X+0.003 7(n=7,R2=0.999 4),曲线如图1所示。

1.4.5 ABTS·自由基清除能力 采用80%的乙醇溶液分别配制提取物及各部分一系列不同质量浓度的样品溶液(0、12.5、25、37.5、50、75、100 μg·mL-1)精密移取0.2 mL样品溶液,再加入1 mL的ABTS·溶液,混匀,于室温下黑暗处理反应30 min后,在734 nm下测定样品的吸光度,抗坏血酸(VC)作阳性对照,按照以下公式计算ABTS·清除率,并计算提取物及各部分样品的半清除率质量浓度(IC50)值(刘春丽等,2014;朱霞等,2014;Wang et al,2015)。

1.4.1 多酚的含量测定 有关对照品溶液的配制以及标准曲线的建立,参考之前的研究(颜小捷等,2013; 王亚凤等,2016),以没食子酸为标准品,采用稍加改进的Folin-酚比色法测定核桃叶提取物及各萃取部分的多酚含量。

2.1.2 核桃叶提取物及各萃取部分的多酚含量测定 由表1可知,核桃叶提取物及其各萃取部分均含多酚类物质,其中萃取后,乙酸乙酯部分和正丁醇部分多酚得到富集,含量更高。

  

图 1 没食子酸标准曲线Fig. 1 Standard curve of gallic acid

在计算教学中,必须注意算理的剖析,引导学生依据算理,理解算法,掌握算法,从而发展学生的智力,并促进运算技能的形成和提高。要提高学生的计算能力,教师要注重学生思维的提高和锻炼,还要增强学生思考的动力,以及对算法的深刻理解。此外,对于学生直观思维的锻炼和培养则需要运用计算中的估算法,这种方法是适当的将实际生活中遇到的一些数学问题引入教学实例中,从而将学生的实际经历和数学知识更加紧密的结合起来,增强其运用数学知识进行解决实际问题的能力,还可以提起学生运用数学方法解决问题的意识。

2.2 抗氧化能力的测定

2.2.1 DPPH·自由基清除能力 从比较表1和表2可以看出,核桃叶75%乙醇粗提物及各萃取部分对DPPH自由基均表现了一定的清除能力。在同一质量浓度范围内,样品的多酚含量与DPPH·清除能力具有明显量效关系。提取物及各萃取部分对DPPH·的清除能力: 乙酸乙酯部分 > 正丁醇部分 > VC > 水部分 > 石油醚部分。乙酸乙酯部分、正丁醇部分的清除能力强于对照VC,提取物的清除能力与VC相当,石油醚部分和水部分的清除能力明显比VC弱。

 

1 核桃叶提取物及不同部分多酚含量的比较Table 1 Comparison between polyphenols contents of extracts from leaves and different fractions of walnut leaves

  

样品Sample总重Totalweight(mg)总体积Total volume(mL)反应用体积Reactionvolume(mL)吸光度A760 nm反应中多酚含量Polyphenolcontent in the reaction (mg)每克中多酚含量Polyphenolcontentper gram(mg·g-1)每部分多酚量占总提物中的百分比Percentage of polyphenols amount in each fraction of total extract(%)核桃叶75%乙醇粗提物Ext.201000.10.1890.010 52.2874.806石油醚部分Fraction of petroleum ether201000.10.1570.008 21.0304.120乙酸乙酯部分Fraction of ethyl acetate 201000.10.3570.022 23.32811.09正丁醇部分Fraction of n-butanol 201000.10.3040.018 52.2579.250水部分Fraction of water 201000.10.1640.008 73.7104.324

2.2.2 ABTS·自由基清除能力 从比较表1和表3可以看出,核桃叶75%乙醇粗提物及各萃取部分对ABTS自由基均表现了一定的清除能力。在同一质量浓度范围内,样品的多酚含量与ABTS·清除力具有很明显的量效关系。提取物及各部分样品对ABTS·自由基的清除能力: 乙酸乙酯部分 > 正丁醇部分 > VC > 粗提物 > 水部分 > 石油醚部分。乙酸乙酯部分、正丁醇部分的清除能力比VC强,粗提物的清除能力与VC相当,而石油醚部分和水部分的清除能力明显比VC弱。

通过以上实验结果可以说明,核桃叶75%乙醇提取物及各萃取部分对DPPH·和ABTS·自由基均表现出一定的清除能力,且清除能力比较强的部分主要集中在乙酸乙酯部分和正丁醇部分。这说明经过简单的萃取操作后,可使核桃叶中的活性物质得到一定的集中, 可为后续分离纯化核桃叶中的多酚类化合物提供一定的依据。

 

2 提取物及各部分样品的清除DPPH·能力Table 2 DPPH·radical scavenging activities of extracts and fractions

  

样品SampleIC50(mg·mL-1)核桃叶75%乙醇粗提物Ext.0.49石油醚部分Fraction of petroleum ether 11.20乙酸乙酯部分Fraction of ethyl acetate 0.19正丁醇部分Fraction of n-butanol 0.21水部分Fraction of water7.57VC0.37

 

3 提取物及各部分样品清除ABTS·的能力Table 3 ABTS·radical scavenging activities of extracts and fractions

  

样品SampleIC50(mg·mL-1)核桃叶75%乙醇粗提物Ext.0.051石油醚部分Fraction of petroleum ether 0.193乙酸乙酯部分Fraction of ethyl acetate0.011正丁醇部分Fraction of n-butanol0.015水部分Fraction of water0.099VC0.020

3 讨论与结论

根据上述研究结果,福林-酚法具有良好的稳定性和可靠性,可用于测定核桃叶和各萃取部分多酚含量。由于多酚类成分极性比较大,且结构不稳定,用不同极性的溶剂对核桃叶提取物干浸膏样品进行预处理,单从得率来看,效果较好,总回收率达到95.46%。预处理所得各部分样品中,多酚含量最高的是乙酸乙酯部分(11.090%),其次是正丁醇部分(9.250%),含量最少的是石油醚部分(4.324%)。经过不同的溶剂萃取后,多酚含量的测定结果表明,核桃叶中多酚类物质得到了一定的集中。通过DPPH·和ABTS·自由基清除结果表明,核桃叶粗提物及其各萃取部分都具有一定的抗氧化能力,而且经过溶剂萃取后,乙酸乙酯部分和正丁醇部分的抗氧化能力明显增强,甚至超过VC 的抗氧化能力。这表明核桃叶粗提物与各萃取部分的抗氧化能力与其多酚的含量成正相关。

本研究前期的结果表明,核桃叶的多酚类物质具有抗菌、抗肿瘤、消炎镇痛和抗氧化等药理的功效。陈宇驰等(2017)通过使用MTS(溴化噻唑蓝四氮唑)检测H2O2诱导氧化应激损伤的H9c2 细胞存活率,结果表明山核桃叶总黄酮可显著地提高氧化应激损伤细胞的存活率,减少细胞凋亡,增加细胞中p-AKT 的表达,但其作用可被PI3Ks 抑制剂LY294002 抵消。张坤等(2013)采用小鼠扭体实验和小鼠福尔马林实验研究山核桃叶总黄酮苷元的镇痛作用,通过小鼠耳廓肿胀实验和棉球肉芽肿胀实验研究山核桃叶总黄酮苷元的抗炎作用,研究结果表明山核桃叶总黄酮苷元具有明显的抗炎镇痛作用。朱亚新等(2014)通过研究核桃多酚提取物及单体对于酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响及作用机理,结果表明核桃多酚提取物有很好的抑制、抗氧化以及减少黑色素的沉积作用。Forino et al(2016)从核桃叶的提取物中分离鉴定出5种化合物,并通过深入评估其影响HepG2和Caco-2细胞系中葡萄糖摄取的潜力,表明核桃叶的提取物具有改善人类高血糖的潜力,可以通过制成含有核桃叶提取物相关功能性饮品来治疗糖尿病。

本研究更进一步地验证并且测定了核桃叶中的多酚类物质含量,以及多酚含量与抗氧化能力的关系,建立了一个测量核桃叶多酚含量的方法,表明核桃叶中含有丰富的多酚类物质,可以作为一种天然的抗氧化物质应用于食品、医疗、美容、保健品等各行业,可以为进一步开发利用核桃资源,提高核桃的资源利用率和经济效益,以及研究其抑菌、抗氧化、杀虫、抗肿瘤等生物方面的活性提供一定的理论基础。

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魏欢,颜小捷,杨建文,李典鹏
《广西植物》 2018年第05期
《广西植物》2018年第05期文献

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