弧菌位于细菌界(Bacteria)、原生动物门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)[1-2]，弧菌属细菌广泛分布于近岸海域海水、沙滩、海洋动物体内和临床样本中，是一类菌体短小，形状弯曲成弧形的革兰阴性细菌[3-4]；副溶血弧菌、创伤弧菌、以及鳗弧菌等是鱼虾贝类常见致病菌，溶藻弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌等均能引起人类的致病[5]，近年来人类因食用感染了病原性弧菌的水产动物而导致腹泻、发热、脱水、呕吐等时有发生[6-9]，对于此类疾病，临床上常使用见效较快的抗生素作为治疗手段。截至到目前，越来越多的耐药菌株产生，超级细菌的报道也屡见不鲜[10]，本研究对中国东海海水进行细菌的分离，并将分离弧菌的耐药性与常见致病弧菌的耐药性进行比对分析，期望能合理使用抗生素、保护海洋环境，具体报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在中国东海海岸线水域(约北纬30°、东经118°)进行海水样品采集。2216(MA)琼脂培养基(美国BD公司)，药敏纸片(北京天坛试剂公司)，pcr仪、扫描电子显微镜由中国科学院微生物研究所公共仪器平台提供；2×EasyTaq PCR SuperMix(北京天根试剂有限公司)。

1.2 菌株的分离与镜检

1.2.1 菌株的分离 中国东海海水样品置于已灭菌样品瓶中，用无菌蒸馏水10倍稀释[11]。2216培养基作为分离菌株培养基121 ℃ 灭菌15 min、倒平板，备用。用无菌枪吸取10 μL稀释液样品直接打入培养基平板上，用无菌涂布棒均匀涂布，放入30 ℃温箱培养7 d。肉眼观察生长出来的菌株，通过形态学观察菌落特征；挑取单个菌落接种在新的2216固体平板培养基中，30 ℃温箱培养2～3 d，获得纯培养菌株。

1.2.2 菌株的镜检 将待检测菌株分别培养20、30和48 h(延滞期、对数生长期、稳定期)3个时间段，菌株在每个时间段均培养一个平板。送至中国科学院微生物研究所公共仪器平台扫描电镜室观察其形态结构，本实验由公共仪器平台梁静楠老师协助完成。

1.3 DNA提取与16S rRNA检测

将分离菌株接种于2216 (MA)培养基上，30 ℃培养36 h；收集培养物，Chelex提取法提取菌株DNA，-20 ℃冰箱冷藏备用。16S rRNA基因扩增和送测：反应体系25 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL，正向引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)1.0 μL，反向引物(1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)1.0 μL，DNA模板1.0 μL，无菌超纯水10 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min为1个循环，扩增35个循环后，72 ℃延伸10 min。PCR扩增完成后，1.5%琼脂糖凝胶中电泳，置于紫外凝胶成像仪中观察目的条带，将合格产物送至北京诺赛基因有限公司测序。菌株测序所得序列与GenBank和EzTaxon-e数据库中进行比对，结果按16S rDNA基因序列相似性>97%的菌株归为同一菌种[12]。

1.4 分离菌株系统发育树的构建

分离菌株测序所得序列与GenBank和EzTaxon-e数据库中进行比对[12]，选取相似性最近的已发表的典型菌株作为参比对象；在NCBI获得相应的序列，经过ClustalX软件对所得序列进行处理对齐[13]，用MEGA5.0软件，采用邻接法构建系统发育树(neighbor-joining)，Bootstrap值为1 000次[14]。

减少环境应激原，以保持宝宝良好的稳定情绪，去除诱发因素，如花粉、灰尘、纤维、宠物、动物皮屑、室外污染物如汽车尾气，经常打扫暗角，晒洗被褥。

1.5 药物敏感性试验的分析

经过稀释后的样本涂布到2216培养基上，在30 ℃温箱培养7 d，肉眼可见到不同颜色、形状的菌株长出。挑取不同形状的菌株，重新三区划线法转接新的无菌培养基平板，得到纯菌株。见图1。

班级划分完毕后，再在每个小班里进行分组，大约5组左右。每个小组就是一个酒店或餐饮企业的宴会部门，可以为自己的小组进行命名（如：香格里拉酒店宴会部）。

2 结果

2.1 平板培养基微生物的生长情况

药敏纸片扩散(Kirby-Bauer)法进行药物敏感性试验，操作和结果判读标准参照美国临床实验室标准化委员会制定的标准。将分离鉴定的弧菌属菌株分别在2216培养基上生长36 h，挑取菌落配制浓度约为0.5麦氏浊度菌悬液(分光光度计值约为0.1 D)；将调好浊度的菌悬液尽快均匀涂布于2216平板培养基上，放置片刻，在培养基底部标记数字符号，以区分不同的抗生素；用无菌镊子贴相应的药敏纸片，保持纸片间距>40 mm。以金黄色葡萄球菌ATCC 25933作为质控菌株，30 ℃温箱培养48 h，观察培养板中抑菌圈生长情况并记录结果，每组细菌样本5次重复。

  

DH-1 DH-2图1 平板培养基微生物的生长情况Fig.1 Colonial morphology of bacteria on solid media

2.2 微生物细胞形态扫描电镜观察

在2216培养基中分离生长的微生物，接种在新的2216(MA)培养基平板进行分离纯化后，得到2株弧菌属细菌，分别命名为DH-1和DH-2。经过革兰染色后，在1 000×镜下观察可见，2株细菌为弯曲呈弧形、菌体红色的革兰阴性细菌。在扫描电镜下可见，菌体DH-1呈微弯曲杆状、极性鞭毛，大小为(0.4～0.6)μm×(0.8～1.0)μm；DH-2呈微弯曲杆状、极性鞭毛，大小为(0.5～0.8)μm×(1.0～2.0)μm。

菌株测序所得序列在GenBank和EzTaxon-e数据库中进行比对，结果显示，2株细菌均属于弧菌属(vibrio)。见图2。根据比对结果，选择与2株同源性较高菌株的16S rRNA序列，经过ClustalX软件对所得序列进行处理对齐，用MEGA5.0软件，采用邻接法构建系统发育树(neighbor-joining)。

2.3 16S rRNA序列及系统发育树的构建

其中，LCCIi为i单元的土地资源承载力指数；Pia为i单元现实人口数量。根据LCCIi的大小就可以量化区域的土地承载力状况，进行评价分级。

  

图2 基于16S rRNA序列构建分离菌株系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rRNA sequence structure

2.4 药敏试验

2株细菌DH-1和DH-2均对氯霉素敏感，对氨苄西林、卡那霉素、万古霉素t 青霉素等耐药，每组样本抑菌圈之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1；

众所周知，我国是煤炭资源大国但是也是消耗煤炭资源的大国。煤炭资源是不可再生的社会发展中必不可少的资源。正因为如此，煤炭资源的开发、利用以及环境问题一直以来都是我国政府以及相关领域重点关注的问题。我国相关领域虽然在煤炭资源的开发与利用方面进行了一定的研究，其管理方法、开发技术虽然在以往的基础上有了很大的进步，但是相比于发达国家而言，我国的开发、利用以及环境治理策略仍处于初级阶段。因此，对于我国煤炭资源的开发、利用以及环境治理方面的研究是十分有必要的。

2.5 菌株DH-1、DH-2与临床常见致病弧菌耐药性比较

 

表1 菌株DH-1和DH-2对常见抗生素药敏试验Tab.1 Drug sensitive test of DH-1 and DH-2 strains against common antibiotics

  

抗生素抗生素符号纸片药物含量/(μg/片)抑菌圈直径(mm)DH-1DH-2万古霉素(Vanco-mycin)VA15--卡那霉素(Kana-mycin)KAN15--新霉素(Neomycin) NEO5-23.01±0.21四环素(Tetracy-cline)TE30--青霉素(Peniciuin)G.P10 IU12.10±0.05-氯霉素(Chloram-phenicol)C3029.01±1.0330.24±0.95阿米卡星(Amika-cin)AN30--头孢噻吩(Cepha-lothin)CF30--多粘菌素(B Poly-myxin)PB1025.16±1.02-氨苄西林(Am-piciuin)AM5- -哌拉西林(Pip-eracillin)PIP1024.10±0.3623.08±1.45链霉素(Strepto-mycin)SM10--

注：“-”表示无抑菌圈

临床常见弧菌属致病菌株的检索：分别在Pubmed、Int J Syst Evol Microbiol、知网等网站上进行文献检索，检索词为弧菌、致病弧菌、弧菌病、细菌与耐药性等词语作为题名、主题词和自由词检索，得到临床常见致病弧菌为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。查找不同致病弧菌菌株对抗生素的耐药情况，选取致病弧菌的综合耐药情况与作者分离到的菌株相比较，结果显示，菌株DH-1、DH-2与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)等常见的临床致病菌株在药敏试验上均对卡那霉素、四环素、青霉素、多粘菌素、氨苄西林和链霉素耐药，尤其对卡那霉素具有相同程度的耐药性。见表2。

 

表2 菌株DH-1、DH-2与致病弧菌耐药性Tab.2 The antibiotic resistance between DH-1, DH-2 with the common pathogenic strains of vibrio

  

抗生素抗生素符号耐药性1234万古霉素(Vancomycin)VA+NDw+卡那霉素(Kanamycin)KAN++++新霉素(Neomycin) NEOw-NDw四环素(Tetracycline)TE+++w青霉素(G Peniciuin) G.Pw+++氯霉素(Chloramphenicol)C-ww-阿米卡星(Amikacin)AN+wNDND头孢噻吩(Cephalothin)CF+NDND-多粘菌素(B Polymyxin)PBw+++氨苄西林(Ampiciuin)AM+++w哌拉西林(Piperacillin)PIP-ND NDND链霉素(Streptomycin)SM+www

注：1为分离菌株DH-1和DH-2，2为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，3为霍乱弧菌(Vibrio cholera)，4为创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，“+”为耐药性强，“-”为无耐药性，“w”为弱耐药性，“ND”为未检索到结果

3 讨论

海洋蕴含丰富的生物、矿物及可再生资源等，与我们生活起着及其重要的作用。近年来，海洋抗生素的污染问题日益加重，对水产养殖业、海洋环境的生态平衡造成一定的影响[15]。海洋抗生素污染主要是通过水产养殖中大量使用抗生素、人类大量服用抗生素后其粪便排入海洋、陆地上某些编码耐药基因的质粒介导和工业废水等途径造成的[16-18]。分离菌株DH-1、DH-2为弧菌，均有极性鞭毛、运动性、革兰染色阴性且镜下形态弯曲呈弧形、最适生长温度30 ℃等生理特征。从分子生物学角度分析，分离菌株DH-1、DH-2分别与Vibrio rumoiensis、Vibrio litoralis和Vibrio agarivorans在16S rRNA序列比对中相似性最高。经药敏试验检测两株菌均有较强的耐药性，本研究将其与临床常见致病弧菌的抗生素耐药性比较，期望得到海洋样品中分离的菌株与临床致病弧菌菌株在某些抗生素耐药方面的区别。分别在Pubmed、Int J Syst Evol Microbiol、知网等网站上进行文献检索，检索词为弧菌、致病弧菌、弧菌病、细菌与耐药性等词语作为题名、主题词和自由词检索，得到临床常见致病弧菌为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)[19-25]。通过查找不同致病弧菌菌株对抗生素的耐药情况，选取致病弧菌的综合耐药情况与作者分离到的菌株相比较， 结果发现菌株DH-1、DH-2与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)等常见的临床致病菌株在药敏试验上均对卡那霉素、四环素、青霉素、多粘菌素、氨苄西林和链霉素耐药，尤其对卡那霉素具有相同程度的耐药性；这一结果进一步从侧面证明了我国海洋抗生素污染的严重程度以及抗生素的滥用。此次研究检测了东海海水微生物的多样性，以及了解到目前海洋环境抗生素的污染情况，应合理使用抗生素，减少抗生素对海洋环境的污染，为保护海洋环境提供理论依据。

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