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过表达和敲除沉默信息调节蛋白6质粒的构建及稳定肺癌A549细胞株的筛选▲

更新时间:2009-03-28

肺癌是全世界死亡率最高的肿瘤之一,其发病率逐年升高,全世界每年新诊断肺癌患者约160万[1]。由于分期和地区的不同,肺癌患者5年生存率存在差异,为4%~17%[2]。早期肺癌以手术治疗辅助化疗为主,晚期肺癌以放疗、化疗等多学科综合治疗为主。随着肿瘤分子生物学研究的不断加深,多学科联合治疗肺癌的临床疗效取得了一定的进展。

沉默信息调节蛋白(silent information regulator protein,SIRT)是一类从细菌到人类都具有高度保守性的蛋白家族,属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,其作用机制是将赖氨酸侧链上的乙酰基转移到辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,产生脱乙酰基底物[3]。其中SIRT6主要定位在细胞核内,通过调节基因组、炎症和糖脂代谢等来影响细胞内稳态,继而影响癌症、糖尿病和肥胖等疾病[4]。在肿瘤细胞方面,SIRT6能抑制低氧诱导因子的表达,而低氧诱导因子是能提高乏氧肿瘤细胞生存率的转录因子[5],因此推断SIRT6和肿瘤乏氧相关。而肿瘤细胞乏氧是放疗抵抗的重要原因,因此明确SIRT6在肺癌中的功能有助于解决放疗抵抗的问题[6]。在炎症调控方面,SIRT6可通过促进DNA损伤修复来维持基因组的稳定,减少活性氧簇的产生[7]。此外,有研究表明,SIRT6 基因缺陷小鼠出现代谢异常、致命性的低血糖、肌肉和脂肪葡萄糖的摄取增多[5]。本研究构建过表达和敲除SIRT6基因质程,筛选肺癌A549细胞系稳定细胞株,旨在为研究SIRT6基因对于肺癌细胞表型的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 肺癌A549细胞株、293T细胞株由上海市肺科医院临床转化中心馈赠,慢病毒质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro-CD513B-1(简称CD513B)、中间质粒pBluescript Ⅱ SK(+)(简称pSK)、pSK-U6-小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)质粒、CD513B-Cas9质粒(NotI酶切)、辅助质粒(PLP1、PLP2、VSVG)均由复旦大学生命科学院实验室提供保存(-80℃保存)。Xba Ⅰ内切酶、Not Ⅰ内切酶、EcoR Ⅴ内切酶、Bas Ⅰ酶、T4 DNA连接酶、KOD重组酶购自美国NEB公司(批号:LN0421504、LN0551703、LN0441408、LN051202、LN03294751、LN626000);大肠杆菌DH5α感受态细胞、基因提取试剂由复旦大学生命科学院实验室提供,胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司(批号:LNQ5502、LNP4721);反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(批号:LNTE001H6);汉恒生物脂质体2000转染试剂购自上海汉恒生物科技有限公司(批号:LN724021);RPMI 1640培养基、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)培养基、胎牛血清购自Thermo公司(批号:LNAC10228370、LNAC13298277、LN1601001);硝酸纤维素膜(简称NC膜)购自美国Millipore公司(批号:LNA10039380),兔抗SIRT6抗体、辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG购自Abcam公司(批号:LN GR183923-16);超纯净水由美国Milli-Pore公司Mill-Q超纯水制备系统所生产;sgRNA序列与PCR所需要引物由上海杰瑞生物工程有限公司提供,测序鉴定工作由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.2 过表达SIRT6基因稳定A549细胞株的筛选

1.2.1 过表达SIRT6基因引物设计和目的基因片段扩增:在美国国立生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询人SIRT6基因序列(NM001193285.2),利用Primer 3.0设计出上下游引物,引物序列如下:上游引物:5′-TCTAGA GCCACCGGAAGCGGCCTCAACAAG-3′(XbaⅠ酶切位点),下游引物:5′-GCGGCCGCCCCGGGGACAGAAACAAGTA-3′(NotⅠ酶切位点),扩增产物大小为1 211 bp。目的基因片段扩增模板来自A549细胞cDNA,反应体系共50 μl:10×KOD重组酶缓冲液5 μl,2 mM脱氧核糖核苷酸5 μl,25 mM硫酸镁3 μl,10 μM上游引物1.5 μl,10 μM下游引物1.5 μl,KODPlus-Neo高保真PCR酶1 μl,人肺癌A549细胞cDNA 2 μl,超纯净水31 μl;反应条件:94℃预变性5 min,98℃变性10 s,60℃退火30 s,68℃延伸90 s,共35个循环;4℃冷却20 min。PCR扩增SIRT6基因序列产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 重组慢病毒质粒的构建:将1.2.1的目的基因条带切胶回收后连接于已被EcoRⅤ酶切的平端pSK质粒上,采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞并涂布于含羧苄青霉素抗性平板,蓝白斑筛选含有目的基因序列的pSK质粒,测序正确后用Xba Ⅰ内切酶、Not Ⅰ内切酶双酶切,37℃酶切14 h,酶切体系共30 μl:10×缓冲液3 μl,Xba Ⅰ内切酶0.5 μl,Not Ⅰ内切酶0.5 μl,载体/片段15 μl,超纯净水11 μl,切胶回收目的基因片段。同时采用Xba Ⅰ内切酶及Not Ⅰ内切酶双酶切CD513B质粒,回收目的基因片段连接在CD513B质粒上,采用热激法转化大肠杆菌感受态细胞并涂布于含羧苄青霉素抗性平板上,37℃培养10~14 h,连接体系共10 μl:10×T4 DNA连接酶缓冲液1 μl,T4 DNA连接酶0.5 μl,CD513B质粒1 μl,目的基因片段2 μl,超纯净水5.5 μl。室温条件下连接2 h。挑取阳性克隆菌落进行菌落PCR鉴定,并挑选有约1 000 bp条带的菌落测序比对分析,测序结果含有目的基因序列即成功构建重组慢病毒质粒(SIRT6-CD513B)。

1.2.3 重组慢病毒包装:以脂质体2000试剂瞬时转染293T细胞,将293T细胞铺板,次日细胞融合度达50%~60%。采用四质粒包装体系包装慢病毒,在无菌1.5 ml EP管中加入245 μl无血清DMEM,将2 μg重组慢病毒质粒SIRT6-CD513B(525 ng/μl)与包装质粒1 μg PLP1(1 646 ng/μl)、1 μg PLP2(1 250 ng/μl)、1 μg VSVG(747ng/μl)按照加入并混匀,同时将2 μg慢病毒空质粒CD513B(770 ng/μl)与包装质粒1 μg PLP1(1 646 ng/μl)、1 μg PLP2(1 250 ng/μl)、1 μg VSVG(747 ng/μl)加入并混匀,作为空白对照。另取2个无菌1.5 ml EP管,分别加入15 μl转染试剂和235 μl无血清DMEM,混匀,室温静置5 min,将慢病毒过表达包装质粒和空白对照慢病毒空质粒分别与转染试剂轻轻混匀,室温静置20 min。弃去293T细胞培养皿中的培养基,加入8 ml无血清DMEM,在培养皿中逐滴加入慢病毒过表达包装质粒混合物,以同样的方法将空白对照慢病毒空质粒混合物逐滴加入另一培养皿中,37℃、5% CO2培养箱中温育4~6 h,弃去转染液,加入含10%磷酸盐缓冲液的DMEM培养液培养72 h,收集培养皿上清液,-80℃保存备用。

1.2.4 A549细胞过表达SIRT6基因:A549细胞消化铺板在6孔板上,密度约为3×105个/ml,次日融合度达60%~70%,弃去6孔板中培养液,加入慢病毒上清液(1 ml/孔)感染A549细胞4~6 h后,补齐培养液至2 ml后继续培养72 h,观察A549细胞荧光感染率。按10‰培养基量加入2 mg/ml嘌呤霉素的比例筛选过表达SIRT6基因细胞系,共筛选3次。

1.2.5 过表达SIRT6基因A549细胞SIRT6蛋白表达水平检测:采用蛋白质印迹法检测A549细胞过表达SIRT6基因后蛋白表达水平。慢病毒感染A549细胞72 h后,提取细胞总蛋白。经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白后,转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜),封闭液封闭1 h;将NC膜封闭兔抗人SIRT6多克隆抗体(1 ∶2 000稀释),4℃孵育过夜;洗涤缓冲液洗涤3次,5~10 min/次,NC膜封闭辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000稀释),室温孵育1 h;洗涤缓冲液洗涤3次,5~10 min/次,增强化学发光法显影。

1.3 敲除SIRT6基因的稳定A549细胞株筛选

1.3.1 SIRT6-sgRNA的获得和敲除质粒的构建:通过网站crispr.mit.edu选择位点,设计引物(见表1)。通过退火获得DNA模板,与pSK-U6-sgRNA(BasI酶切)连接,连接体系:10×T4 DNA连接酶缓冲液1 μl,T4 DNA连接酶1 μl,pSK-U6-sgRNA(BasI酶切)50 ng,退火产物1 μl,补充二次蒸馏水至总体系为10 μl、室温条件下连接6 h。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,用拨棒均匀的涂布在含有氨苄霉素的LB培养基上,提取pSK-U6-sgRNA质粒。

 

1 设计引物序列

  

引物第一外显子靶序列第二外显子靶序列SIRT6⁃sgRNA上游引物TTTGCTGTCGCCGTACGCGGACAAGTTTTGGTGGTGTTCCACACGGGTGCGTSIRT6⁃sgRNA下游引物TAAAACTTGTCCGCGTACGGCGACAGTAAAACGCACCCGTGTGGAACACCAC

1.3.2 SIRT6-sgRNA载体的构建准备:通用鼠U6引物扩增CD513B-Cas9(NotI酶切)两端15 bp同源臂。设计引物扩增pSK-U6-sgRNA两端15 bp同源臂,引物设计:NotI-HR-U6-sgRNA上游:GATCGCAGATCCTTGCGGCCGCCCGCTCTAGAGATCCGAC,下游:TCCAATTCACTGGCGCGGCCACTATAGGGCGAATTGGGTACC,将扩增好带有同源臂pSK-U6-sgRNA质粒与CD513B-Cas9(Not Ⅰ酶切)质粒重组。将重组产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,用拨棒均匀的涂布在含有氨苄霉素的LB培养基上,测序验证SIRT6-sgRNA是否连接到CD513B-Cas9(Not Ⅰ酶切)上,测序验证若含有靶序列即为连接成功,提示敲除质粒构建成功。将含有第一外显子靶序列的敲除质粒简称为SIRT6-sgRNA1,将含有第二外显子靶序列的敲除质粒简称为SIRT6-sgRNA2。

1.3.3 A549细胞敲除SIRT6基因和敲除结果检测:用含10%胎牛血清的1640培养基常规传代培养A549细胞。将A549细胞以3×105个/孔铺于6孔板中,次日融合度达到60%~70%,取敲除质粒SIRT6-sgRNA1(470 ng/μl)3 μg、SIRT6-sgRNA2(390 ng/μl)3 μg、脂质体2 000转染试剂9 μl,加入235 μl无血清1640培养基中,静置20 min,将敲除质粒和转染试剂混合物悬空逐滴加入10%胎牛血清1640培养基中,48 h后消化细胞,同时按10‰培养基量加入2 mg/ml的嘌呤霉素的比例进行筛选3次,得到混合克隆细胞系,无限稀释法稀释混合克隆细胞系至10 cm细胞皿细胞个数为100个。37℃、5% CO2培养箱中温育2周后10 cm细胞皿中的每个克隆群落细胞个数达50个以上时挑取单克隆细胞,将单克隆细胞冻存,提取其DNA、蛋白,DNA测序敲除碱基情况,蛋白质印迹法检测SIRT6蛋白表达水平,具体操作步骤同1.2.5。

2

2.1 SIRT6基因扩增鉴定结果 SIRT6基因PCR产物经1.2%琼脂凝胶电泳鉴定,可见大小约为1 200 bp的条带,即为目的基因SIRT6条带,见图1。

  

图1 SIRT6目的基因扩增产物

 

注:M为DNA分子量标准,1~4为目的基因扩增产物。

2.2 含目的基因的中间质粒pSK和慢病毒质粒CD513B的酶切鉴定结果 连接目的基因后双酶切中间质粒pSK及CD513B质粒鉴定得约1 200 bp的条带,提示目的基因成功连接到中间质粒pSK和慢病毒质粒CD513B上,见图2~3。

  

图2 双酶切中间质粒pSK鉴定

注:M为DNA分子量标准,1~4为Xba Ⅰ和Not Ⅰ双酶切中间质粒pSK,5~6为空白对照。

  

图3 双酶切重组慢病毒质粒CD513B鉴定

注:M为DNA分子量标准,1~6 为Xba Ⅰ和Not Ⅰ双酶切重组慢病毒质粒CD513B,7~8为空白对照。

2.3 过表达SIRT6基因的稳定A549细胞株荧光感染率 荧光检测结果显示感染荧光效率接近100%,见图4。

 

A 荧光图 B 白光图

图4 过表达SIRT6的A549细胞感染情况

2.4 过表达SIRT6的A549细胞SIRT6蛋白表达水平 采用蛋白质印迹法检测结果显示蛋白表达水平提高,见图5。

  

图5 蛋白质印迹法检测各组A549细胞中SIRT6蛋白表达水平

注:WT为没有任何处理的A549细胞对照组,1~2为敲除SIRT6基因的A549细胞,3为感染CD513B空质粒的A549细胞,4~5为过表达SIRT6的A549细胞。

2.5 SIRT6-sgRNA载体的构建结果 第一外显子、第二外显子的靶序列和测序结果对比成功,表明SIRT6-sgRNA成功插入带有Cas9的CD513B上,见图6。

  

图6 敲除载体测序结果对比

2.6 敲除SIRT6基因的A549细胞系测序检测结果 通过挑取单克隆细胞,提取不同单克隆细胞DNA进行测序,敲除结果分为4类:完全敲除基因双链、多碱基或碱基替换、敲除基因单链、敲除内含子部分碱基。见图7。

  

图7 敲除细胞系挑取单克隆细胞测序结果对比

注:a为完全敲除基因双链28个碱基,b为完全敲除基因双链24个碱基,c为多碱基或碱基替换,d为敲除基因单链,e为敲除内含子部分碱基。

2.7 敲除SIRT6基因的A549细胞系蛋白表达水平 结果显示除7号样本敲除第一外显子上24个碱基和10~12号样本敲除内含子部分碱基的细胞系以外,其余细胞系均有移码突变基因,翻译均提前终止,SIRT6蛋白未见表达,而7号样本由于敲除24个碱基而导致SIRT6蛋白分子量变小,见图8。

  

图8 敲除细胞系SIRT6蛋白表达量

注:WT为对照组,1为第一外显子上多碱基G,2、5、6为敲除第一外显子单链上23个碱基,3、4、9为第一外显子上多碱基A,7为敲除第一外显子上24个碱基,8为敲除第一外显子上28个碱基,10~12为敲除内含子部分碱基。

3

SIRT6通过影响细胞转录活性,维持基因组稳定性和端粒酶完整性,促进DNA损伤修复和调控炎症因子分泌,从而发挥抗衰老以及调控炎症反应、代谢相关疾病、肿瘤的发生等作用[8]。已有研究表明,SIRT6基因表达量变化可影响部分肿瘤表型。其中,肝癌细胞SIRT6表达量降低,过表达SIRT6基因通过细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated kinase,ERK)1/2通路可抑制肝癌细胞增殖[9];在前列腺癌中,抑制SIRT6基因的表达可阻滞癌细胞进行G1期,降低癌细胞增殖能力,同时增加化疗药物敏感性[10]。有学者发现TRA2B-DNAH5融合基因通过SIRT6-ERK1/2基质金属蛋白酶信号轴来促进肺鳞癌的进展[11],环磷酸腺苷信号能通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号级联通路减少SIRT6基因的表达,提高肺癌放射凋亡率[12]。筛选过表达和敲除SIRT6基因细胞系并研究其在放射性肺损伤和肺癌代谢中的作用,首先必须寻找能携带SIRT6基因进入癌细胞并使基因稳定表达的载体。

田间除草采用机械中耕除草、人工与化学除草相结合的方法。苗前化学除草:选用爱玉优、乙草胺、异丙草胺、噻吩磺隆等药剂。苗后化学除草:一般在玉米苗后3~5叶期,禾本科杂草3叶前,阔叶杂草2~4叶期施药。选用烟嘧磺隆、硝磺草酮、莠去津等药剂,以上药剂在施药时可加喷液量0.5%~1%的植物油或多功能喷雾助剂。

目前常用基因编辑技术为规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/(Cas9),其是在细菌和古生物菌存在的一种获得性免疫系统。CRISPR由高度保守的重复序列和间隔序列组成;Cas基因是一类基因家族,其编码的蛋白具有和核酸结合以及执行敲除的功能,最常用的是CRISPR/Cas9蛋白[13]。CRISPR/Cas9系统通过靶序列对应的RNA序列与外源DNA互补,引导Cas9内切酶对互补的靶序列进行双链切割,从而对基因进行修饰,和第一、二代基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单,基因修饰可无限遗传,多位点敲除基因,成本低且细胞毒性低的特点[14]。CRISPR/Cas9技术已成为一种高效、便利、强大的基因打靶技术,其被应用于整体生物模型中,用于揭示与肿瘤进化和转移相关的一些基因[15]。利用此技术可清除人T细胞基因组中的HIV-1,为治愈HIV感染铺平道路[16];同时此技术可使癌症突变失活,80%的突变都可被此技术系统切割修饰[17]。因此本研究选择应用重组慢病毒表达系统载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除SIRT6基因的载体。通过对SIRT6基因第一和第二外显子的SIRT6-sgRNA测序,发现两外显子靶点序列均在敲除质粒上,说明成功构建SIRT6基因的敲除质粒。利用CRISPR/Cas9技术敲除SIRT6基因第一外显子上不同位点碱基,造成不同程度移码突变,得到不同突变A549细胞系,SIRT6蛋白均未无表达;而第二外显子靶点均敲除在内含子上,SIRT6蛋白仍稳定表达。

慢病毒表达系统载体是以HIV-Ⅰ为基础的载体,慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞。慢病毒包装技术的优势是慢病毒感染宿主细胞时,可携带目的基因随机、稳定地整合进入宿主细胞基因组中,实现目的基因稳定、长期的表达,同时不易引起宿主免疫反应,因此其非常适合用于基因过表达细胞株的建立[18]。本研究中,测序结果显示SIRT6基因成功连接到CD513B质粒上,说明成功构建过表达SIRT6基因质粒,感染A549细胞后SIRT6蛋白在A549细胞中已稳定过表达。同时本研究采用四质粒慢病毒表达系统,即一个穿梭质粒(CD513B)提供顺式作用组件和3个包装质粒(PLP1、PLP2、VSVG)提供反式作用组件,通过“自我灭活”的方式抑制病毒自我复制,保证慢病毒质粒生物安全性。本研究利用CD513B质粒的嘌呤霉素抗性以及表达绿色荧光蛋白的特点,可更直观地观察过表达质粒与A549细胞基因组的整合,且质粒转染效率接近100%,此外,同时利用中间质粒pSK能更精确地将目的基因片段连接到CD513B质粒上。

为据Wk中对角阵Wjj计算得到的块对角阵,称为理想分割状态的Laplacians矩阵,Lkj=Ij-Dj-1Wjj为Wjj的Laplacians矩阵,Ij为nj阶单位阵,nj为类别j对应区域内像素数,Dj=diag(di,i=1,2,…,nj)且为Wk中非对角块Wjj′影响产生的扰动项[18].

总之,本研究通过质粒构建成功筛选过表达和敲除SIRT6基因的稳定A549细胞株,从而为进一步研究SIRT6基因在肺癌发生发展中的具体作用奠定了基础。

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吴爱鲁,梁世雄,宋晓,付佳美,周子洋,宋晓婷,赵志鹏,张春燕
《广西医学》 2018年第08期
《广西医学》2018年第08期文献

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