非小细胞肺癌为临床常见恶性肿瘤，流行病学调查显示，近几年其发病率呈逐年上升趋势，占肺癌的75%～85%，大部分患者确诊时已属晚期，需接受以全身化疗为主的综合治疗，其中吉西他滨联合铂类是其标准治疗方案之一[1]。但有资料显示，非小细胞肺癌患者即使病理类型及分期一致，对同一种化疗方案的敏感性也存在一定差异；换言之，同一肿瘤、分期的非小细胞肺癌患者接受相同化疗方案，其短期疗效仍存在个体差异[2]。而有报道称谷胱甘肽S转移酶P1基因(Glutathione S-transferases P1，GSTP1)作为体内重要的致癌物Ⅱ相代谢酶基因，在维持细胞代谢分解致癌物、抗氧化损伤、抑制细胞癌变过程中起着重要作用；而肺癌患者GSTP1基因启动子区呈高甲基化状态，其GSTP1基因启动子甲基化水平与肺癌化疗疗效相关[3]。然而目前有关GSTP1基因启动子甲基化水平与非小细胞肺癌化疗疗效的相关性报道仍不充分，国内报道较为少见[4]。基于此，本文主要深入探究非小细胞肺癌化疗短期疗效与GSTP1基因启动子甲基化水平的相关性，报道如下。

大班幼儿对于图形学习已经拥有了较深的认识，同时他们也开始围绕平面图形与立体图形的认知展开有效研究，但这个时期幼儿的认知整合仍然停留于实践层面，还未能从概念层次认识和理解图形。因此教师在教学过程中必须要帮助幼儿认识图形特征，探究图形之间的关系，巩固幼儿对图形的理解和认识。例如，教师可以利用多媒体技术构建全新的游戏教学环境，将二维图形与三维图形进行联合展示，看看哪个小组的幼儿能够更好地区分出不同图形之间的差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2016年3月到2018年3月于我院与中山大学孙逸仙纪念医院收治的100例非小细胞肺癌患者为研究对象，开展回顾性分析。本研究已获得院伦理委员会批准。纳入标准：(1)符合《2010中国肺癌临床指南》[5]中非小细胞肺癌诊断标准，并均经细胞学、组织学、病理学等检查确诊；(2)参考2009年第七版病理TNM分期标准[6]，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期；(3)均首次接受吉西他滨联合顺铂治疗，预计生存期>3个月；(4)年龄≥18岁，一般状况卡劳夫斯基评分(Kamofasky，KPS)>60分；(5)所有患者对本研究知情且签署同意书。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾及血液系统、免疫系统等原发性疾病及精神疾患；(2)Ⅰ期、Ⅱ期非小细胞肺癌；(3)入组前3个月内接受放化疗或其他治疗者；(4)伴肺心病、慢性支气管炎、肺气肿或其他严重疾病；(5)存在恶性肿瘤病史或合并其它恶性肿瘤；(6)过敏体质或对本研究化疗药物过敏；(7)妊娠期或哺乳期妇女。100例患者中男75例，女60例；年龄25～78岁，平均(57.29±12.13)岁。

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1.2 化疗方案

所有患者均接受GP化疗方案，第1、8、15 d，静滴吉西他滨(健择，ELI LILLY AND COMPANY，注册证号H20110535)1 000 mg/m2；第1、2、3 d，静滴顺铂(诺欣，江苏豪森药业股份有限公司，国药准字H20040813)30 mg/m2。以28 d为1个化疗周期，隔3周重复化疗，持续2个化疗周期。一旦疾病出现进展，或伴严重不良反应而难以忍受，则立即停药。

1.3 检测方法

1.3.1 仪器与试剂 仪器包括Light Cycler 480Ⅱ实时荧光定量仪(德国Roche公司)、聚合酶链反应(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)基因扩增仪2720(美国ABI公司)、Nanodropl000核酸定量仪(美国Thermo公司)，其他仪器如SW-CJ净化工作台、低温高速离心机、倒置显微镜、干式恒温器等均购自大连宝生物工程有限公司。Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、甲基化DNA检测试剂盒、PCR-HRM分析试剂盒(Eva Green)均由上海生工生物技术服务有限公司生产，人甲基化标准品购自大连宝生物工程有限公司。

2个周期化疗后评价短期疗效，参考WTO实体瘤疗效评价标准进行疗效判定[7]：(1)完全缓解(Complete response，CR)，CT示肿瘤病灶完全消失，持续时间>4周；(2)部分缓解(Partial response，PR)，肿瘤病灶最大直径与其相垂直径线乘积缩小>50%，持续时间>4周，未出现新病灶；(3)疾病稳定(Stable disease，SD)，肿瘤病灶最大直径与其相垂直径线乘积增大<25%，或缩小<50%；(4)疾病进展(Progressive disease，PD)，肿瘤病灶最大直径与其相垂直径线乘积增大>25%，或存在新病变。其中，CR、PR、SD均归入疾病控制组，其余纳入疾病未控制组。

1.3.3 DNA亚硫酸氢盐甲基化修饰及构建标准品 参考甲基化DNA检测试剂盒操作说明书，留取20μL DNA溶液，行DNA亚硫酸盐修饰、回收，修饰纯化后行PCR或置入?20℃冰箱保存备用。100%甲基化标准品选择全基因组甲基化标准品，以100%全基因组非甲基化健康人外周血DNA为稀释剂，依据不同比例分别配制不同甲基化程度标准品(0、5%、10%、20%、25%、50%、100%)。通过PCR扩增后，行高分辨率熔解曲线(High resolution melting assay，HRM)检测，获取标准曲线。

100例非小细胞肺癌患者均接受GP化疗方案，2个化疗周期后CR 4例，占4.00%；PR 45例，占45.00%；SD 40例，占40.00%，均归入疾病控制组。PD 11例，占11.00%，归入疾病未控制组。

1.4 观察指标

2017年9月，原国家新闻出版广电总局印发《新闻出版广播影视“十三五”发展规划》，到2020年数字期刊收入达到37亿元；推进传统新闻出版业在人员、理念、模式、市场和服务等更高层面全面加快数字化转型升级步伐。在重点产业发展方面提出加快发展内容产业，充分发挥在内容方面的核心优势，巩固提升期刊产业。这一目标与要求将大大的促进互联网期刊的持续快速高质量的发展并促进互联网期刊行业的转型升级。同时在“十三五”期间建立新闻出版单位“双效”建设评价考核指标体系，制定实施图书、音像电子、报纸、期刊及网络文学出版和新华书店等出版发行企业加强社会效益评价考核办法。

1.3.2 标本采集及DNA提取 将一次性灌洗液标本瓶与支气管镜连接，纤支镜置入患者支气管处，经纤支镜吸引管道口予以灌洗，采集肺泡灌洗液标本，以1 000 r/min离心10 min，以吸管吸取、丢弃上清，于离心管底部留存细胞中置入适量细胞保存液，并置入20 ℃冰箱保存待测。参考DNA抽提试剂盒操作说明书，提取DNA。结束后，采用Nanodropl000核酸定量仪，行DNA浓度及纯度测定，光密度(OD)值(A260nm/A280 nm)保持1.7～1.9。满足纯度要求后凝胶电泳检测DNA质量，置入?20 ℃冰箱保存备用。

统计患者基线资料，包括性别、年龄、KPS评分、吸烟指数、病理类型、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤部位、肿瘤细胞分化程度，并于2个周期化疗后抽取患者清晨空腹静脉血2 mL，行血液常规检测，测定血红蛋白、血小板数量。观察非小细胞肺癌患者化疗后短期疗效，按照其疗效，将患者划分为疾病控制组、疾病未控制组，分析两组GSTP1启动子甲基化水平。

1.5 统计学方法

由此可见，传统教学模式与PBL教学模式各有优势和缺陷，培养当代医学生科研能力需要两者有机结合。只有这样才能让学生既不疏于基础学习又不乏于理论创新；既不疏于基本技能提升又不乏于科研能力锻炼；既不疏于原始理论学习又不乏于新知识新事物的接受。因此，我们需要加强教学模式转变，强化PBL教学意识。

2 结果

2.1 患者短期疗效分析

1.3.4 GSTP1启动子甲基化水平测定 采用Methprimer软件，行GSTPl基因PCR-HRM引物涉及，上游引物5’-GTGAAGCGGGTGTGTAAGTTT-3’，下游引物5’-TAAACAAACAACAAAAAAAAAACC-3’。参考PCR-HRM分析试剂说明书，添加PCR反应体系后予以HRM分析。PCR反应体系总体积为20 μL，组成成分如下：2×HRM Analysis PreMix 10 μL，上下游引物(浓度300nmol/L)各0.6 μL，22ng亚硫酸盐修饰后DNA模板，其余以DEPC水补足。PCR扩增条件：95 ℃预变性5min，95℃变形10s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环55次。设置熔解曲线分析参数(95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃1 s)，速度调整为0.02 ℃/s，自65 ℃升温至95 ℃，收集熔解曲线数据，每间隔1 ℃行荧光采集25次。将获取的标准品及样本熔解曲线，导入Light Cycler 480 genescanning软件中，获取甲基化分型图谱，评估标准曲线与样本曲线之间的位置，获取样本甲基化水平数据。

2.2 疾病控制组与疾病未控制组基线资料对比

疾病控制组KPS评分<80分、TNM分期处于Ⅲa期、肿瘤直径≤5 cm、肿瘤细胞分化程度为低分化、血小板计数≤300×109/L所占比例均显著高于疾病未控制组(P<0.05)，其它基线资料较疾病未控制组比较无统计学意义(P>0.05)，见表1。

采用SPSS 19.0处理数据，计量资料用表示，组间比较使用t检验。计数资料计算构成比，组间比较使用χ2检验；单因素分析行χ2检验，并以多因素Logistic回归分析法分析非小细胞肺癌化疗短期疗效的独立影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.3 两组GSTP1基因启动子甲基化检测结果比较

以非小细胞肺癌患者化疗后短期疗效为因变量，将上述有差异的单因素作为自变量，按照连续变量赋值，纳入多因素Logistic回归统计分析，采用逐步回归方法筛选变量。结果显示，除KPS评分、TNM分期、肿瘤直径、分化程度、血小板计数外，GSTP1基因启动子甲基化率亦为非小细胞肺癌化疗短期疗效的独立影响因素(P<0.05)，见表3。

2.4 影响化疗短期疗效的多因素Logistic回归分析

疾病控制组GSTP1基因启动子甲基化率为15.73%，疾病未控制组为54.54%，差异有统计学意义(χ2=9.219，P<0.05)，见表2。

 

表1 疾病控制组与疾病未控制组基线资料

  

指标疾病控制组(n=89)疾病未控制组(n=11)t/χ2P年龄(岁, x±s)52.49±12.1052.50±11.460.0050.996性别(例) 男6480.0030.954 女253KPS评分(例) ≥80分2264.3200.038 <80分675吸烟指数(例) ≥400年/支3040.0310.861 <400年/支597病理类型(例) 鳞癌485 腺癌3636.7330.081 大细胞癌42 其他11TNM分期(例) Ⅲa722 Ⅲb17347.0480.000 Ⅳ05肿瘤直径(例) >5 cm2874.4550.035 ≤5 cm614肿瘤部位(例) 周围型3550.1530.695 中央型546肿瘤分化程度(例) 高中分化3484.7900.029 低分化553血小板计数(例) >300×109/L22914.9220.000 ≤300×109/L672血红蛋白(例) >110 g/L1220.1790.672 ≤110 g/L779

 

表2 两组GSTP1基因启动子甲基化检测结果比较[例(%)]

  

组别例数0～5%5%～10%10%～20%20%～25%25%～50%50%～100%合计疾病控制组 891(1.12)3(3.37)4(4.49)2(2.25)2(2.25)2(2.25)14(15.73)疾病未控制组113(27.27)2(18.18)1(9.09)0(0.00)0(0.00)0(0.00)6(54.54)

 

表3 影响化疗短期疗效的多因素Logistic回归分析

  

指标β值标准误WaldP值OR95%CIKPS评分1.2070.26620.5890.0003.3381.997～5.595TNM分期0.7260.19214.2980.0052.1161.162～3.692肿瘤直径1.2320.22629.7170.0003.4252.217～5.292肿瘤细胞分化程度1.2020.36011.1480.0003.3272.220～4.979血小板计数1.2700.26722.6250.0013.5681.680～7.568GSTP1基因启动子甲基化率0.6350.3024.4210.0361.8871.048～3.410

3 讨论

非小细胞肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，有资料显示，其手术成功率较低，预后较差，5年生存率为8.60%左右[8]。化疗作为非小细胞肺癌综合治疗的关键手段之一，于术前辅助化疗利于降低肿瘤分期，促使手术切除率提高，延长晚期非小细胞肺癌患者生存期；而顺铂药物联合吉西他滨是目前治疗晚期非小细胞肺癌的有效方案之一。

本研究结果显示，100例非小细胞肺癌患者均接受GP化疗方案，2个化疗周期后疾病控制率为89.00%，证实GP化疗方案治疗非小细胞肺癌短期疗效确切，这与李琳琳等[9]研究结论一致。究其根源，顺铂为细胞周期非特异性药物，属铂类金属络合物，药物可作用于肿瘤细胞周期中任意时相；其中，作用于有丝分裂期、S期作为突出，可诱导DNA 链内(或链间)交联，刺激DNA修复，诱导其凋亡，从而实现疾病治疗目的[10]。而吉西他滨亦为细胞周期特异性药物，进入人体后，作用于S期细胞，阻止G1期进展为S期，基于脱氧胞嘧啶激酶活化前提下，由胞嘧啶核苷脱氨酶代谢[11]。笔者认为，顺铂联合吉西他滨治疗具有协同作用，可抑制癌细胞生长繁殖，杀灭癌细胞，预防癌症转移、复发，延长患者生存期。

本研究显示，疾病控制组GSTP1基因启动子甲基化率为15.73%，明显高于疾病未控制组，且Logistic回归分析证实，除KPS评分、TNM分期、肿瘤直径、分化程度、血小板计数外，GSTP1基因启动子甲基化率亦为非小细胞肺癌化疗短期疗效的独立影响因素，证实GSTP1基因启动子甲基化有可能成为预测为非小细胞肺癌化疗短期疗效的重要标志。文献报道，非小细胞肺癌与职业和环境接触、吸烟、慢性肺疾病、遗传等因素有关，其中遗传因素在其发病机制研究中被列为重点内容，基因水平异常改变一定程度上可提高其发病风险[12]。Tan等[13]也发现恶性肿瘤的形成、发展、侵袭、转移及预后与GSTP1基因启动子甲基化水平有关；尤其是肺癌，其化疗疗效个体差异与GSTP1基因启动子甲基化水平有关，非小细胞肺癌组织或外周血标本中GSTP1基因甲基化可明显影响吉西他滨联合铂类药物治疗非小细胞肺癌的疗效。GSTP1为肺组织中含量最高的谷胱甘肽S转移酶，而谷胱甘肽S转移酶属Ⅱ相代谢酶，参与代谢多种促癌物质(诱变剂、致癌物和化学药物等)结合还原型谷胱甘肽，形成易排泄物质，机体解毒作用明显，并可抵抗外界损伤。同时，谷胱甘肽S转移酶存在多种类型结构相似的同工酶，其中GSTP1基因编码的GST-π与肿瘤形成、发展、预后有关[14]。GSTP1基因处于11号染色体长臂13，包括6个内含子、7个外显子，有报道称GSTP1基因表达缺失后，机体对多环芳香烃降解作用减弱，而多环芳香烃为致癌性较强的致癌物，香烟燃烧、染料不完全燃烧都可诱导多环芳香烃大量形成；而谷胱甘肽S转移酶存在多环芳香烃分解作用，一旦GSTP1基因表达缺失，则会增强多环芳香烃致癌作用，其对肺癌的易感性增加，提示GSTP1基因表达缺失会导致机体对致癌作用因子的解毒作用下降，对环境致癌物的敏感性增加，肺癌发病风险上升[15]。Wang等[16]证实GSTP1基因启动子CpG岛高甲基化会抑制GSTP1基因转录，促使GSTP1基因呈低水平表达，导致GSTP1基因解毒功能减弱，提示GSTP1甲基化可能促进肺癌发病进程，影响其化疗疗效。而GSTP1基因启动子甲基化率越高，肿瘤细胞DNA修复能力较强，化疗疗效相对欠缺，这充分证实了本文研究结论。

祝国寺历史很短，但已经与东川的社会和文化有一定程度的融入。记者注意到，省民族宗教委提出的宗教场所“五进”的要求，在这里不仅落实，而且落实得有创意，有超前性。

综上，GSTP1基因启动子甲基化水平可能会影响非小细胞肺癌化疗短期疗效，临床上应引起足够重视。但本文由于样本量偏少，观察时间较短，未涉及GSTP1基因高甲基化对非小细胞肺癌化疗远期疗效的影响；韩志刚等[17]报道GSTP1基因高甲基化与地理环境、种族遗传等因素有关，而本文未涉及此方面，故今后仍需深入调查研究。

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