轮状病毒(rotavirus，RV)是引起幼龄动物和婴幼儿急性肠胃炎的一种常见病原体，全世界约有100万5岁以下儿童的死亡与RV感染有关[1]。非结构蛋白4(NSP4)是由RV基因编码的含175个氨基酸的多功能蛋白。1996年Ball等[2]首次提出RV NSP4可能是一种肠毒素，经腹膜内或十二指肠内注射6～10日龄小鼠后能诱导剂量依赖性的腹泻，因此认为NSP4可能与RV的毒力有关。近年来NSP4在RV致病机制中的作用越来越受到重视，其可通过钙离子依赖性的信号转导途径激活氯离子分泌，从而在RV致病过程中发挥重要作用[3]。

始载于《神农本草经》，毛茛科植物白头翁的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢等功效[4]，临床上主要用于溃疡性结肠炎、慢性结肠炎、慢性腹泻、急性菌痢等。三萜皂苷类是白头翁的主要药用成分，具有抗炎、抗菌等药理活性[5]。本研究采用人轮状病毒NSP4真核表达质粒转染细胞，探讨白头翁总皂苷对NSP4过表达引起细胞炎性因子水平及核因子κB(NF-κB)p65蛋白表达的影响。

为了验证试验模型的正确性，结合实际情况，按照乙醇浓度40%、浸提时间60 min、浸提温度40℃、浸提pH 6.6，进行5次重复试验验证，测得甜菜苷类色素含量的平均值为4.35 mg/100g，与预测值的相对误差为4.13%，充分验证了模型的正确性。该参数具体有效。在此条件下，甜菜苷类色素含量的预测值为5 mg/100g，实际测得甜菜苷类色素提取量平均为4.35 mg/100g，提取率为87.19%，与预测值的相对误差为4.13%，充分验证模型的正确性。与赵珍珍[10]的研究结果相近，说明参数有效。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白头翁总皂苷购自南京道斯夫生物科技有限公司，实验前用0.1%的DMSO溶解，配制成浓度为20、50 μmol/L的溶液。人结肠癌细胞株HT-29细胞购自武汉普诺赛生物科技有限公司，用含10% FBS的高糖DMEM培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 NSP4过表达载体构建

克隆编码NSP4的序列片段(672 bp)到pLV.O慢病毒载体(广州辉园苑)构建NSP4过表达载体pLV.O-NSP4。用于阴性对照的pLV.O-NC购自广州辉园苑医药科技有限公司。

1.3 细胞转染

为解决电加热启停带来的温湿度惯性，SCR电加热初始以30%的热量输出。当室内环境制热量需求变化时，根据PID控制算法，SCR可控硅电加热无级调节输出精确的加热量。

1.4 NSP4基因表达检测

响应快捷化：①对当班发生的变化情况必须详细记录发生时间、地点、影响范围，按变化性质与要求及时汇报，立即启动响应程序；②对上一班延续的变化项目，要详细跟踪落实变化进展情况，确保闭合管理；③发生瓦斯等有害气体报警或超限时，必须在3分钟之内汇报上级部门并及时落实事故原因；④对所有变化环节响应，全部规范时间标准，要求所有响应步骤全部在规定时间内完成。

1.5 炎性因子水平检测

用50 μmol/L白头翁总皂苷处理HT-29-NSP4细胞，同时设置HT-29-NC及HT-29-NSP4细胞作为对照，用0.1%的DMSO处理。48 h后收集细胞沉淀，提取总蛋白，BCA法定量，各组上样10 μg后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。按常规方法电转至PVDF膜，用BSA TBST缓冲液37 ℃封闭1 h，NF-κB p65抗体和β-actin抗体(美国CST)37 ℃孵育90 min，过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体37 ℃孵育1 h，DAB法显色，Image-Pro Plus软件进行定量分析。

载体构建完成后，用pPACKH1包装质粒混合液(美国SBI)转染pLV.O-NSP4或pLV.O-NC到293TN细胞株，3 d后根据说明书用Lenti-Concentin病毒沉淀溶液(美国SBI)提取收集病毒颗粒，然后用TransDux病毒转染试剂(美国SBI)转染HT-29细胞株。

1.6 NF-κB p65蛋白表达检测

分别用20、50 μmol/L白头翁总皂苷溶液处理HT-29-NSP4细胞，同时设置HT-29-NC及HT-29-NSP4细胞作为对照，用0.1%的DMSO处理。48 h后收集细胞细胞上清液，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)及IL-8水平。试剂盒由武汉纯度生物科技有限公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据以表示，多组间比较用方差分析；方差齐性时组间两两比较用LSD法，方差不齐时用Dunnett T3法。检验水准取α=0.05。

1.7 统计学处理

2007—2016年，东营市绿色经济发展过程中居民生活消费系统得分整体呈现上升趋势。生活消费系统得分从2007年的0.007 5上升到2016年的0.0148。究其原因，在于政府绿色经济发展观念有所增强，东营市围绕建设美丽幸福新东营的目标，牢牢把握生态宜居城市的发展定位，实施了3大类77个建设项目，累计投资12亿元，一大批事关城市功能完善和增加市民福祉的大项目、好项目建成并投入使用，这进一步增强了中心城的承载能力和服务功能。2007—2016年，东营市人均道路面积不断增加，公共交通数量上升，为城市绿色经济建设提供了基础设施支持和社会发展驱动力。

2 结果

2.1 NSP4过表达细胞株的构建

旱育秧苗床的供肥量能基本满足秧苗正常生长，三叶期后若补肥则应同时补水。用尿素10g/m2 100倍液均匀喷施，再用清水喷淋洗苗，移栽前几天可按尿素75kg/hm2标准适当施送嫁肥。

病毒转染后荧光显微镜可见HT-29-NSP4和HT-29-NC荧光率达95%以上，见图1A。PCR显示，HT-29-NSP4组NSP4 mRNA表达量较HT-29-NC组显著升高(P<0.01)，见图1B。说明NSP4过表达细胞株构建成功，可进行后续研究。

  

白光荧光HT-29-NCHT-29-NSP4AB**5004003001086420HT-29-NSP4HT-29-NCRelativeExpressionofNSP4mRNAlevel

注：A：病毒转染效果观察；B： NSP4 mRNA表达检测(PCR)；与HT-29-NC组比较，*P<0.01

图1 NSP4过表达细胞株的鉴定

2.2 IL-6及IL-8检测

ELISA检测显示，与HT-29-NC组比较，HT-29-NSP4组细胞上清液中IL-6及IL-8水平均显著升高(均P<0.05)；与HT-29-NSP4组比较，20、50 μmol/L白头翁总皂苷组的IL-6及IL-8水平均显著降低(均P<0.05)，说明白头翁总皂苷可显著抑制NSP4过表达引起的细胞炎性因子释放。

取1.3中收集的细胞沉淀，高纯总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取总RNA。以提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR检测HT-29-NC及HT-29-NSP4细胞中NSP4 mRNA表达。引物序列：NSP4上游引物：5′-GCAAGCGACATACGAGGAGA-3′，下游引物：5′-CGCTCCCAATGTAAGCATGG-3′；β-actin上游引物：5′-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT-3′，下游引物：5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成引物。实时荧光定量PCR检测采用SYBR Green?染料法，反应条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40个循环。

 

表1 白头翁总皂苷干预对细胞上清液IL-6及IL-8水平的影响

  

组别IL-6(pg/mL)IL-8(pg/mL)HT-29-NC131.3±2.256.6±0.8HT-29-NSP4175.0±2.2∗93.6±4.1∗20 μmol/L白头翁总皂苷153.4±4.4#81.0±1.9#50 μmol/L白头翁总皂苷137.0±3.6#73.2±4.2#

注：与HT-29-NC组比较，*P<0.05；与HT-29-NSP4组比较，#P<0.05

2.3 NF-κB p65蛋白表达检测

与HT-29-NC组比较，HT-29-NSP4组细胞NF-κB p65蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)；与HT-29-NSP4组比较，50 μmol/L白头翁总皂苷组NF-κB p65蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。见图2。说明白头翁总皂苷可显著抑制NSP4过表达引起的细胞NF-κB p65蛋白表达增加。

  

HT-29-NCHT-29-NSP4白头翁总皂苷NF-κBp65β-actin65KDa42KDa*#1.00.80.60.40.20.0白头翁总皂苷HT-29-NSP4HT-29-NCRelativeexpressionofNF-κBp65proteinlevelBA

注：A：NF-κB p65蛋白表达检测(免疫印迹)；B：NF-κB p65蛋白相对定量；与HT-29-NC组比较，*P<0.05；与HT-29-NSP4组比较，#P<0.05

图2 白头翁总皂苷干预对细胞NF-κB p65蛋白表达的影响

3 讨论

NSP4是一个内质网跨膜糖蛋白，是RV编码的肠毒素，在RV的致病中起着关键作用。首先，NSP4能转移到内质网并破坏细胞内钙离子平衡，直接影响上皮细胞的完整性及膜通透性；Hyser等[6]认为NSP4可引起肠上皮Cl-的增多和水的分泌，直接抑制钠-葡萄糖转运体的转运。其次，已有研究表明，NSP4过表达能增加caspase-3和caspase-9活性，也能促进促凋亡蛋白Bax的表达[7]。此外，谢力等[8]使用非复制的腺病毒表达系统，构建了能表达人RV NSP4的重组腺病毒，对乳鼠攻毒后发现NSP4可诱导小鼠的免疫反应。已有研究表明肠道免疫细胞及相关炎性因子水平与RV致腹泻也有着密切联系[9]，本研究通过克隆编码NSP4的序列片段到pLV.O慢病毒载体，经病毒包装后感染HT-29细胞株，研究NSP4过表达对细胞炎性因子水平的影响，PCR结果显示HT-29-NSP4组NSP4 mRNA表达量显著升高，说明NSP4过表达细胞株构建成功，HT-29细胞可稳定表达NSP4基因，可用于后续研究；ELISA结果显示，NSP4过表达可导致HT-29细胞IL-6及IL-8炎性因子分泌增加。

张晓利等[10]报道，白头翁复方能显著增强腹泻小鼠肠道粘膜乳糖酶活性，从而实现止泻的作用。Lee等[11]报道，白头翁提取物能够动态平衡Th1/Th2，在脂多糖诱导的炎症动物模型中可减少IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等促炎因子分泌，从而实现抗炎、抑制免疫的功效。本研究采用不同浓度的白头翁总皂苷干预HT-29-NSP4细胞，结果发现，不同浓度的白头翁总皂苷可显著降低HT-29-NSP4细胞中炎性因子IL-6及IL-8水平。

NF-κB是一种高度保守的核转录因子，广泛存在于各种组织，参与细胞凋亡、肿瘤细胞黏附及免疫炎症反应等过程中相关基因的转录调控。NF-κB p65在正常组织不表达或低表达，而在炎症期有不同程度的高表达[12]。NF-κB在炎症损伤过程中发挥关键的枢纽作用，是多种抗炎药物的靶标，通过抑制NF-κB信号转导通路降低炎性介质表达。本研究通过检测各组细胞NF-κB p65蛋白表达水平，探讨白头翁总皂苷是否通过作用于NF-κB通路抑制HT-29-NSP4细胞中炎性因子分泌和表达，结果发现NSP4过表达细胞中NF-κB p65蛋白表达显著增加，而白头翁总皂苷干预后NF-κB p65蛋白表达显著减少，提示白头翁总皂苷可能通过作用于NF-κB通路减轻NSP4过表达引起的细胞炎性损伤。

综上述，本研究使用人RV NSP4真核表达质粒转染细胞，建立了一种体外人RV NSP4致细胞炎症模型，使用不同浓度的白头翁总皂苷干预发现白头翁总皂苷可能通过作用于NF-κB通路抑制NSP4过表达引起的细胞炎性因子释放，为进一步研究人RV的致腹泻机理、治疗和预防等方面提供了依据。

参考文献

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[2] Ball JM，Tian P，Zeng CQ，et al. Age-dependent diarrhea induced by a rotaviral nonstructural glycoprotein[J]. Science，1996，272(5258)：101-104.

[3] 徐倏燊，王健伟，何雅青，等. 人轮状病毒NSP4基因变异与功能关系的初步研究[J]. 病毒学报，2002，18(2)：113-117.

[4] 连姗，江蔚新，薛睿. 白头翁皂苷成分及药理作用研究进展[J]. 亚太传统医药，2016，12(2)：35-38.

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[8] 谢力，王晓囡，李杨，等. 表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价[J]. 中国生物工程杂志，2014，34(2)：1-6.

[9] Zhang B，Chassaing B，Shi Z，et al. Viral infection. Prevention and cure of rotavirus infection via TLR5/NLRC4-mediated production of IL-22 and IL-18[J]. Science，2014，346(6211)：861-865.

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